一種癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法和檢測方法技術

本專利屬于免疫傳感器領域，具體公開了一種癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法和檢測方法。分別包括以下步驟：取聚鄰苯二胺納米微球利用超聲震蕩分散在水中，并在室溫下保存備用；利用戊二醛修飾玻碳電極；并將該電極浸入HRP標記的CEA抗體溶液與聚鄰苯二胺納米微球溶液的混合液中得到聚鄰苯二胺納米微球/HRP標記的CEA抗體修飾電極；CEA標準樣品配置成濃度不同的溶液作為測試溶液；然后分析物在H

Preparation method and detection method of carcinoembryonic antigen electrochemical immunosensor

The utility model belongs to the field of immunity sensors, in particular discloses a preparation method and a detection method of an carcinoembryonic antigen electrochemical immunosensor. Including the following steps: taking poly-o - two amine nanoparticles dispersed in water by ultrasonic vibration, and stored at room temperature; using glutaraldehyde modified glassy carbon electrode; and then CEA antibody modified electrode poly-o - two amine nanoparticles labeled /HRP CEA antibody mixture solution of the electrodes immersed in HRP labeled with poly the adjacent benzene two amine nanoparticles solution; CEA standard sample configuration solution with different concentration as the test solution; then the analyte in H

【技術實現步驟摘要】
一種癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法和檢測方法
本專利技術涉及免疫傳感器領域，具體涉及一種癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法和檢測方法。
技術介紹
癌胚抗原(CEA)是一種分子量極大的糖蛋白，常用于腫瘤標記。CEA濃度的檢測不僅可以用于胃腸道和呼吸道的腫瘤診斷，還可以通過檢測人體內癌胚抗原的含量及量的變化，表明腫瘤的性質，從而對腫瘤的診斷、病程分析及指導臨床治療起輔助作用。因此CEA濃度的測定對臨床腫瘤診斷具有重大的意義。癌胚抗原的定量檢測方法最常見的分析方法包括熒光免疫法，酶聯免疫吸附測定法，電化學免疫傳感器測定法，放射免疫測定法，電化學發光免疫測定法和質譜免疫測定法。其中電化學免疫傳感器測定法具有分析速度快、儀器裝置簡便、靈敏度高等優點。電化學免疫傳感器可分為阻抗型免疫傳感器、電容型免疫傳感器、電位型傳感器和電流型傳感器。電流型免疫傳感器是在電位一定的情況下測定由于抗原抗體特異性結合成復合物后電流的改變，它又分為酶標記型和非酶標記型。目前，常用的非酶標記型電化學免疫傳感器如化學(物理)吸附、共價鍵結合、交聯法、嵌入法等，都暴露出檢測時間長、費用高、生物分子穩定性低、生物分子失活性高、步驟復雜的缺點。而酶標記型電化學免疫傳感器有很多酶可以用于酶標記型免疫傳感器，如辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶和脲酶。酶生物傳感器是通過檢測酶促反應產生的H2O2，但這類酶生物傳感器會受到溶解氧的嚴重影響而導致電化學響應不穩定。常用的生物電化學傳感器都需要比較復雜的檢測步驟，并且需要徹底清洗才能使用，非常容易使檢測結果出現錯誤。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種癌胚抗原電化學免疫傳感器，其具有靈敏度高、結果準確可靠、成本低、快速、使用方便且制備過程極其簡單的特點。為達到上述目的，本專利技術的技術方案為，其制備方法具體步驟如下：步驟1：取聚鄰苯二胺納米微球0.013g，利用超聲震蕩分散在1mL的水中，并在室溫下保存備用；步驟2：將玻碳電極:用清洗劑超聲清洗5～10min后，在沉積電位為1.75V下，0.1MpH＝5.0的PBS中，用線性掃描溶出伏安法沉積300s，得到處理后的玻碳電極；步驟3：處理后的玻碳電極在掃描電位為+0.3～+1.3V，pH＝7.0的PBS中做循環伏安曲線直到獲得穩定的電流電壓曲線為止；步驟4：:將此電極浸泡在20mM的戊二醛溶液中12～24h，得到戊二醛修飾的玻碳電極；步驟5：用水充分清洗以除去玻碳電極上非化學吸附的戊二醛，把該電極浸入100μLHRP標記的CEA抗體溶液與200μL聚鄰苯二胺納米微球溶液的混合液中5～10h后得到聚鄰苯二胺納米微球/HRP標記的CEA抗體修飾電極；步驟6：用水將電極沖洗干凈，晾干；步驟7：將干燥后的免疫傳感器于含有0.04％BSA的PBS溶液中4℃下浸泡1～3h，將制備好的免疫傳感器泡于4℃0.1MpH＝7.0的PBS中，即可得到癌胚抗原電化學免疫傳感器。2，檢測方法步驟1：取5μL的CEA標準樣品配置成濃度為0.1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的溶液作為測試溶液，并在室溫(25±1.0℃)下孵育10～60min；步驟2：測試溶液在2.0mMH2O2和pH＝5.0～8.0無氧的PBS混合溶液中進行差分脈沖伏安掃描，其掃描電壓為-0.5～-0.75V；步驟3：啟動電化學反應，分別測量0.1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的CEA溶液對應的電流強度，建立電化學電流強度與CEA溶液濃度之間的定量關系。本方案的優點在于：1，聚鄰苯二胺納米微球的制備采用臭氧作為氧化劑，不僅產物無污染，在氧化過程中也不會帶入金屬雜質。2，這種免疫傳感器中含有的聚鄰苯二胺納米微球帶有正電荷的氨基與帶負電的玻碳電極發生靜電結合作用，聚鄰苯二胺納米微球同時與戊二醛反應，從而有利于酶的固定。聚鄰苯二胺納米微球和戊二醛應用于酶生物傳感器中，構建電極與酶的氧化還原位點之間的直接電子轉移，從而消除溶解氧的干擾。聚鄰苯二胺具有固化酶、高的選擇通透性、良好耐腐蝕性能，同時還具有豐富的氨基和亞氨基，有利于抗體蛋白質的功能化和提高酶的生物活性。3，納米微球的比表面積大，進一步提高了暴露在晶體外部的氨基和亞氨基數量，提高了檢測的靈敏度和穩定性，其線性范圍0.1～50ng/ml，檢測限最低0.05ng/ml，表明該免疫傳感器可以達到準確測定的目的。該傳感器制備方法簡單、成本低、靈敏度高、穩定性好。4，檢測只需要一步即可，檢測步驟簡單方便，不容易出錯。進一步，所述聚鄰苯二胺納米微球的制備方法為：200μL0.1M鄰苯二胺加入3mL水中，向溶液中通入30ml/min的臭氧并不斷攪拌，在常溫下攪拌3～5h后將反應得到的產物在7000G的重力加速度下離心5min，分離得到的沉淀物即是聚鄰苯二胺納米微球。專利技術人通過實驗發現采用上述參數制備的聚鄰苯二胺納米微球粒徑最均勻。進一步，所述清洗劑超聲清洗先經過體積比為1:1的HNO3溶液清洗，然后通過甲苯或者無水乙醇清洗，最后采用純水清洗干凈，專利技術人通過實驗發現使用這種組合的清洗劑和清洗方式可以徹底洗去附著在電極表面的有機物雜質。進一步，所述電極浸泡在20mM的戊二醛溶液中12h，可以使電極表面完全附著戊二醛，同時也不會在電極表面物理吸附過量戊二醛，造成浪費。進一步，所述通入臭氧的速率為30ml/min，攪拌時間為5h，該方法制得的聚鄰苯二胺納米微球的直徑為200nm，攪拌時間太短，形成的納米微球粒徑不均勻，影響電化學免疫傳感器的穩定性。進一步，所述測試溶液孵育時間為40min，專利技術人通過大量實驗發現，采用上述溶液孵育時間，癌胚抗原電化學電流響應最明顯，傳感器測試的靈敏度最高。進一步，所述無氧的PBS的混合溶液的pH＝7.0，專利技術人通過實驗發現，采用上述條件癌胚抗原蛋白的活性最高。附圖說明圖1是本專利技術實施例1納米聚鄰苯二胺納米微球的電子顯微鏡圖片；圖2是本專利技術癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備流程圖；圖3是本專利技術實施例1，2～7檢測方法中不同pH值的PBS-響應電流強度線性圖；圖4是本專利技術實施例1，8～13檢測方法中不同的孵育時間-響應電流強度線性圖；圖5是本專利技術檢測癌胚抗原電化學免疫傳感器在不同癌胚抗原濃度下的線性擬合圖。具體實施方式下面通過具體實施方式對本專利技術作進一步詳細的說明：說明書附圖中的附圖標記包括：。本說明書中使用的術語“HRP”指：辣根過氧化物酶；“CEA”指：癌胚抗原；“BSA”指：牛血清白蛋白；“PBS”指：磷酸緩沖鹽溶液。實施例1：1、聚鄰苯二胺納米微球的制備(POPD)200μL0.1M鄰苯二胺加入3mL水中，向溶液中通入30ml/min的臭氧并不斷攪拌，在常溫下攪拌5h后將反應得到的產物在7000G的重力加速度下離心5min，分離得到的沉淀物即是聚鄰苯二胺納米微球。2、免疫傳感器的制備步驟1：將玻碳電極分別用0.3μm和0.05μm的Al2O3拋光；步驟2：先用1:1的HNO3超聲清洗5min后，再采用無水乙醇超聲清洗5min，最后采用純水超聲清洗5min；在沉積電位為1.75V下，0.1MpH＝5.0的PBS中，用線性掃描溶出伏安法本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于具體制備步驟如下，步驟1：取聚鄰苯二胺納米微球0.013g，利用超聲震蕩分散在1mL的水中，并在室溫下保存備用；步驟2：將玻碳電極：用清洗劑超聲清洗5～10min后，在沉積電位為1.75V下，0.1M?pH＝5.0的PBS中，用線性掃描溶出伏安法沉積300s，得到處理后的玻碳電極；步驟3：處理后的玻碳電極在掃描電位為+0.3～+1.3V，pH＝7.0的PBS中做循環伏安曲線直到獲得穩定的電流電壓曲線為止；步驟4：:將此電極浸泡在20mM的戊二醛溶液中12～24h，得到戊二醛修飾的玻碳電極；步驟5：用水充分清洗以除去玻碳電極上非化學吸附的戊二醛，把該電極浸入100μL?HRP標記的CEA抗體溶液與200μL聚鄰苯二胺納米微球溶液的混合液中5～10h后得到聚鄰苯二胺納米微球/HRP標記的CEA抗體修飾電極；步驟6：用水將電極沖洗干凈，晾干；步驟7：將制備好的免疫傳感器浸泡于4℃?0.1M?pH＝7.0的PBS中，即可得到癌胚抗原電化學免疫傳感器。

【技術特征摘要】
1.一種癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于具體制備步驟如下，步驟1：取聚鄰苯二胺納米微球0.013g，利用超聲震蕩分散在1mL的水中，并在室溫下保存備用；步驟2：將玻碳電極：用清洗劑超聲清洗5～10min后，在沉積電位為1.75V下，0.1MpH＝5.0的PBS中，用線性掃描溶出伏安法沉積300s，得到處理后的玻碳電極；步驟3：處理后的玻碳電極在掃描電位為+0.3～+1.3V，pH＝7.0的PBS中做循環伏安曲線直到獲得穩定的電流電壓曲線為止；步驟4：:將此電極浸泡在20mM的戊二醛溶液中12～24h，得到戊二醛修飾的玻碳電極；步驟5：用水充分清洗以除去玻碳電極上非化學吸附的戊二醛，把該電極浸入100μLHRP標記的CEA抗體溶液與200μL聚鄰苯二胺納米微球溶液的混合液中5～10h后得到聚鄰苯二胺納米微球/HRP標記的CEA抗體修飾電極；步驟6：用水將電極沖洗干凈，晾干；步驟7：將制備好的免疫傳感器浸泡于4℃0.1MpH＝7.0的PBS中，即可得到癌胚抗原電化學免疫傳感器。2.根據權利要求1所述的癌胚抗原電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述聚鄰苯二胺納米微球的制備方法為：200μL0.1M鄰苯二胺加入3mL水中，向溶液中以30ml/min的速度通入臭氧并不斷攪拌，在常溫下攪拌3～5h后將反應得到的產物在7000G的重力加速度下離心5min，分離得到的沉淀物即是聚鄰苯二胺納米微球。3.根據權利要求1或2所述的癌胚抗原電化...

【專利技術屬性】
技術研發人員：田亮亮，李璐，陳賢，閆興武，劉碧桃，程江，楊鑫，
申請(專利權)人：重慶文理學院，
類型：發明
國別省市：重慶,50