一種可降低非特異性影響流感疫苗血清效價的評價方法技術

本發明專利技術涉及一種可降低非特異性影響流感疫苗血清效價的評價方法。具體地，本發明專利技術涉及一種改善的血凝抑制試驗方法以及其在檢測受試者血清抗體中的用途。另一方面，本發明專利技術提供了一種評估流感疫苗血清效價的方法。了一種評估流感疫苗血清效價的方法。

【技術實現步驟摘要】
一種可降低非特異性影響流感疫苗血清效價的評價方法


[0001]本專利技術涉及抗體檢測的
具體地，本專利技術涉及一種改善的血凝抑制試驗以及其在檢測受試者血清抗體中的用途。

技術介紹

[0002]血凝抑制試驗是開展免疫程序制定及免疫效果監測等的主要手段之一。其免疫保護效果以血凝抑制(HI)抗體滴度作為免疫原性評價指標。血凝抑制試驗是目前WHO進行全球流感監測所普遍采用的試驗方法之一。
[0003]血凝抑制試驗中由于涉及紅細胞凝集及抗原
?
抗體的特異性反應，試驗本身非特異性較差，而且多數動物血清、體液、組織液中均存在抑制素，與紅細胞表面受體存在相似的物質，它們能與紅細胞受體一起競爭性地被病毒表面血凝素所識別和結合，影響該方法用于評價血清中流感病毒特異性中和抗體，表現為未免疫疫苗的動物血清流感病毒中和抗體測值較高，嚴重干擾用該方法評價疫苗的有效性，使得血凝抑制試驗方法可在非臨床試驗或臨床試驗研究評價中不能發揮其作用。所以必須將非特異性抑制素去除干凈，才能準確地測定血清中流感病毒特異性抗體效價。血凝抑制(HI)試驗本身由于步驟繁多，試驗過程也常受多種因素影響，容易造成偏差。
[0004]為了克服現有技術中的缺陷，本專利技術旨在提供一種可降低非特異性影響的流感疫苗血清效價評價方法，實現該方法適用于不同物種免疫前后血清中流感病毒特異性抗體的檢測。

技術實現思路

[0005]在第一方面，本專利技術提供了一種改善的血凝抑制試驗方法，其包括以下步驟:
[0006]1)提供包含白羽雞紅細胞的紅細胞懸液，
[0007]2)去除待檢測樣品中的非特異性抑制素，優選地，通過加入霍亂濾液和白羽雞紅細胞去除非特異性抑制素；
[0008]3)使用步驟1)中的紅細胞懸液制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原，和
[0009]4)進行紅細胞凝集抑制試驗。
[0010]在具體的實施方案中，本專利技術的紅細胞懸液為1％的白羽雞紅細胞懸液。
[0011]在具體的實施方案中，所述紅細胞懸液通過以下步驟制備：
[0012]1.1)獲得來自白羽雞的全血，
[0013]1.2)將步驟1.1)中獲得的全血與阿氏液混合，所述阿氏液為包含葡萄糖2.05g/100ml、檸檬酸鈉0.8g/100ml、檸檬酸0.055g/100ml和氯化鈉0.42g/100ml的水溶液，pH6.1，經高壓滅菌后2
?
8℃保存；
[0014]1.3)將步驟1.2)的混合物在2～8℃、2800rpm/分鐘，離心10分鐘，棄去上清后，加入0.9％氯化鈉溶液，然后再在2～8℃、2800rpm/分鐘，離心10分鐘，棄去上清，重復該操作
過程至少3次，得到白羽雞紅細胞；
[0015]1.4)將步驟1.3)中的白羽雞紅細胞加入到0.9％氯化鈉溶液中。
[0016]在具體的實施方案，通過以下步驟去除待檢測樣品中的非特異性抑制素：
[0017]2.1)向1倍體積的待檢測樣品中加入3倍體積的霍亂濾液，在37℃條件下水浴18
?
20小時，然后置56℃水浴30～60分鐘；
[0018]2.2)加入0.5倍體積的白羽雞紅細胞，混勻，在2
?
8℃反應過夜；和
[0019]2.3)2000rpm/分鐘，離心5分鐘，吸取上清液，獲得去除非特異性抑制素的待檢測樣品。
[0020]在本專利技術的具體實施方案中，所述待檢測樣品為受試者體液或組織液，優選地，所述待檢測樣品為受試者血清或待分離血漿。
[0021]在本專利技術的具體實施方案中，所述受試者可以是任何哺乳動物，包括但不限于人、大鼠、小鼠、豬、豚鼠等。
[0022]在本專利技術的具體實施方案中，所述待檢測樣品是免疫前或免疫后的免疫動物血清。
[0023]在具體的實施方案中，通過以下步驟制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原：
[0024]3.1)在96孔板中用生理鹽水對抗原或病毒液進行系列倍比稀釋，并包括生理鹽水的陰性對照；優選地，在稀釋步驟中采用固定稀釋混勻吹打至少15次，稀釋時每更換一列即更換槍頭的操作；
[0025]3.2)每孔加入等體積的1％包含白羽雞紅細胞的紅細胞懸液，使反應物混合均勻，20～25℃下靜置45～55分鐘，讀取抗原的血凝滴度；
[0026]3.3)根據血凝滴度結果用生理鹽水稀釋為4個血凝單位病毒液，其中能使紅細胞完全凝集的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝滴度，設定為1個血凝單位，4倍最高稀釋度即為4個血凝單位；和
[0027]3.4)對4個血凝單位的病毒液需按照血凝滴度法回滴，確定是否為4個血凝單位，若不足或高于4個血凝單位，則需補加或稀釋直至病毒液經回滴為4個血凝單位為止。
[0028]在具體的實施方案中，用于制備紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原的抗原或病毒液為流感病毒的抗原或病毒液，包括H1N1、H3N2、Bv(B/Victoria)和By(B/Yamagata)中的一種或多種。
[0029]在本專利技術的具體實施方案中，對于一些分型的病毒，例如，甲型流感病毒，在用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原制備完成60分鐘內進行紅細胞凝集抑制試驗；對于一些分型的病毒，例如，乙型流感病毒，在120分鐘內進行紅細胞凝集抑制試驗。
[0030]在具體的實施方案中，在無菌級的一次性96孔微量反應板中使用包含白羽雞紅細胞的紅細胞懸液進行紅細胞凝集抑制試驗。
[0031]在另一方面，本專利技術提供了改善的血凝抑制試驗用于檢測受試者血清中流感病毒抗體效價中的用途，尤其是用于評估流感疫苗血清效價中的用途。
[0032]在具體的實施方案中，本專利技術的方法可用于評估二價、三價、或四價流感疫苗的血清效價。
[0033]在另一方面，本專利技術提供了一種評估流感疫苗血清效價的方法，所述方法包括：
[0034]1)獲得流感疫苗免疫前、免疫后的受試者血清，優選地，所述受試者為人或非人哺乳動物，優選地，所述受試者為人、大鼠、小鼠、豬、豚鼠；
[0035]2)提供包含白羽雞紅細胞的紅細胞懸液；
[0036]3)去除步驟1)中獲得的受試者血清中的非特異性抑制素；優選地，通過加入霍亂濾液和白羽雞紅細胞去除非特異性抑制素；
[0037]4)使用步驟2)中的紅細胞懸液制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原，所述抗原為H1N1、H3N2、Bv和By中的一種或多種，和
[0038]5)在無菌級的一次性96孔微量反應板中使用包含白羽雞紅細胞的紅細胞液進行紅細胞凝集抑制試驗；其中對于甲型流感病毒，在步驟4)完成60分鐘內進行步驟5)；對于乙型流感病毒，在步驟4)完成120分鐘內進行步驟5)。
附圖說明
[0039]圖1.樣品A血凝滴度變化
[0040]圖2.樣品B血凝滴度變化
[0041]圖3.樣品C血凝滴度變化
[0042]圖4.樣品D血凝滴度變本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種改善的血凝抑制試驗方法，其包括以下步驟:1)提供包含白羽雞紅細胞的紅細胞懸液，優選地，所述包含白羽雞紅細胞的紅細胞懸液為1％的紅細胞懸液；2)去除待檢測樣品中的非特異性抑制素，優選地，通過加入霍亂濾液和白羽雞紅細胞去除非特異性抑制素；3)使用步驟1)中的紅細胞懸液制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原，和4)進行紅細胞凝集抑制試驗。2.根據權利要求1所述的改善的血凝抑制試驗方法，其中所述紅細胞懸液通過以下步驟制備：1.1)獲得來自白羽雞的全血；1.2)將步驟1.1)中獲得的全血與阿氏液混合，所述阿氏液為包含葡萄糖2.05g/100ml、檸檬酸鈉0.8g/100ml、檸檬酸0.055g/100ml和氯化鈉0.42g/100ml的水溶液，pH6.1，經高壓滅菌后2
?
8℃保存；1.3)將步驟1.2)的混合物在2～8℃、2800rpm/分鐘，離心10分鐘，棄去上清后，加入0.9％氯化鈉溶液，然后再在2～8℃、2800rpm/分鐘，離心10分鐘，棄去上清，重復該操作過程至少3次，得到白羽雞紅細胞；和1.4)將步驟1.3)中的白羽雞紅細胞加入到0.9％氯化鈉溶液中。3.根據權利要求1所述的改善的血凝抑制試驗方法，其中通過以下步驟去除待檢測樣品中的非特異性抑制素：2.1)向1倍體積的待檢測樣品中加入3倍體積的霍亂濾液，在37℃條件下水浴18
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20小時，然后置56℃水浴30～60min；2.2)加入0.5體積的白羽雞紅細胞，混勻，在2
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8℃過夜反應；和2.3)2000rpm/分鐘，離心5分鐘，吸取上清液，獲得去除非特異性抑制素的待檢測樣品。4.根據權利要求1
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3中任一項所述的改善的血凝抑制試驗方法，其中所述待檢測樣品為受試者體液或組織液，優選地，所述待檢測樣品為受試者血清或待分離血漿。5.根據權利要求4所述的改善的血凝抑制試驗方法，其中所述受試者選自人、大鼠、小鼠、豬和豚鼠。6.根據權利要求1所述的改善的血凝抑制試驗方法，其中通過以下步驟制備用于紅細胞凝集抑制試驗的4個血凝單位抗原：3.1)在96孔板中用生理鹽水對抗原或病毒液進行系列倍比稀釋，并包括生理鹽水的陰性對照；3.2)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：韓博，孫小麗，?；勖?/a>，
申請(專利權)人：江蘇益明榮藥醫療科技有限公司，
類型：發明
國別省市：