一種體外脂肪肝類器官模型及其制備方法與在藥物測試中的應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種體外脂肪肝類器官模型及其制備方法與在藥物測試中的應(yīng)用，具體涉及生物墨水、器官模型技術(shù)領(lǐng)域。生物墨水由細胞懸浮液和水凝膠混合、吹打獲得，該墨水明膠、海藻酸鈉、纖維蛋白原、層粘連蛋白及其細胞的最終濃度為：5％(w/v)，1％(w/v)，1mg/ml、30μg/ml和1

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種體外脂肪肝類器官模型及其制備方法與在藥物測試中的應(yīng)用


[0001]本專利技術(shù)涉及器官模型
，具體涉及一種體外脂肪肝類器官模型及其制備方法與在藥物測試中的應(yīng)用。

技術(shù)介紹

[0002]世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球有3.5億人患有肝病，每年有100多萬人因此死亡，與肝病相關(guān)的死亡人數(shù)還在逐步增加。當(dāng)肝臟中脂肪含量超過5％時，即可認為患有脂肪肝。脂肪變性是脂肪肝最重要的標(biāo)志，脂肪肝可以從脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎，在更嚴重的情況下，可發(fā)展為肝纖維化和肝硬化，最終可能導(dǎo)致肝細胞癌。因此，脂肪肝需要及早診斷和治療。
[0003]目前的脂肪肝臨床治療方法有藥物治療、介入治療、手術(shù)治療等方法。藥物治療是最方便且對機體副作用最小的治療方式，但是治療脂肪肝并沒有很強針對性的或者療效較好的藥物，所以開發(fā)療效好的、副作用小的新藥就尤為重要。在過去的幾年中，研究人員采取了不同的方法來開發(fā)NAFLD動物模型，如：專利CN114916497A、專利CN112352739A構(gòu)建一種非酒精性脂肪肝小鼠模型用于科學(xué)研究。使用動物模型進行實驗研究存在一些問題，如倫理糾紛、耗時長、成本高等，且動物模型在理化微環(huán)境與代謝能力方面與人體存在著顯著性差異。因此，迫切希望能夠研發(fā)出一種在形態(tài)、理化微環(huán)境及代謝能力等方面與人體高度相似的脂肪肝類器官模型，并能夠有效的代替動物用于研究脂肪肝的病理機制及相關(guān)藥物測試。
[0004]類器官屬于三維細胞培養(yǎng)物，含有單一成體干細胞或者通過多能干細胞的定向誘導(dǎo)分化都能夠產(chǎn)生類器官，其包含其代表器官的一些關(guān)鍵特性，并能夠在許多系統(tǒng)中進行無限期傳代和長期培養(yǎng)。到目前為止，類器官培養(yǎng)已用于各種組織器官，其中包括腸道、肝臟、胰腺、腎臟等。3D生物打印技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，現(xiàn)已成為21世紀最具發(fā)展?jié)摿Φ那把丶夹g(shù)之一。現(xiàn)已有研究人員使用功能細胞和水凝膠的聚合物利用3D生物打印技術(shù)在體外成功構(gòu)建了肝類器官樣結(jié)構(gòu)，在疾病病理學(xué)、精準醫(yī)療以及藥物毒性測試等領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用。如Yang等人用明膠和海藻酸鈉利用擠壓式打印構(gòu)建了體外肝組織模型，顯示出良好的細胞
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細胞、細胞
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細胞基質(zhì)之間的相互作用，結(jié)構(gòu)具有高度完整性，且肝組織的生物學(xué)表征高度表達。然而，構(gòu)建成熟的血管樣通道向肝細胞供應(yīng)氧氣和營養(yǎng)仍然是一項技術(shù)挑戰(zhàn)。
[0005]目前尚未見到有關(guān)3D生物打印技術(shù)用于構(gòu)建脂肪肝類器官模型的報道。3D打印脂肪肝類器官模型的關(guān)鍵因素是用于3D生物打印的原材料，即生物墨水。然而，基于生物打印技術(shù)構(gòu)建個性化定制的脂肪肝類器官模型還處于初級階段，目前用于生物打印的墨水，不具有良好的生物相容性，穩(wěn)定性差且細胞存活率較低，很難模擬相應(yīng)的生物結(jié)構(gòu)的組織樣結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)細胞與微環(huán)境之間的信息交換，達到高度仿生，無法很好應(yīng)用于后續(xù)的研究。公布號為CN108310463A的專利申請公開一種3D打印生物墨水及其制備方法，但該墨水很難進
行脂肪肝類器官模型的打印，且很難維持后期培養(yǎng)。
[0006]有鑒于此，我們提出一種生物打印脂肪肝類器官模型的制備方法，解決現(xiàn)有類器官系統(tǒng)的一些局限，填補利用肝類器官研究脂肪肝的疾病機制和藥物測試方面的空白，為藥物研究和肝組織工程領(lǐng)域提供了一種新的工具。
[0007]現(xiàn)有的脂肪肝模型都是依賴動物模型來進行病理機制研究，鑒于人類疾病的復(fù)雜性，迄今為止，沒有任何一種動物模型能夠完全概括人類疾病的狀態(tài)。與人體具有顯著性代謝差異是動物模型的主要缺點。誘導(dǎo)動物產(chǎn)生脂肪肝的致病性刺激是人工的，通常與人類發(fā)病機理無關(guān)。不同脂肪肝動物模型的誘導(dǎo)方式的不一致，這也會導(dǎo)致實驗結(jié)果的不準確，如公布號為CN114503955A，采用敲除小鼠的NR4A1
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基因敲除的小鼠來構(gòu)建脂肪肝小鼠模型，公布號為CN113796324A采用高果糖飲食來誘導(dǎo)構(gòu)建脂肪肝小鼠模型。此外，出于道德倫理的考慮，越來越不鼓勵使用實驗動物。目前大部分的生物墨水均具有一定的機械性以及生物相容性，但對于體外3D細胞模型培養(yǎng)，如何提高細胞活力成為了亟待解決的問題。現(xiàn)有的一些研究人員將一些細胞生長因子加入生物墨水，來提高細胞活力，但是水凝膠組分配比與生長因子濃度的不同會導(dǎo)致細胞活力的不同，所以，很多體外3D細胞模型的培養(yǎng)都不能很好的模擬人體內(nèi)的細胞復(fù)雜的功能，導(dǎo)致研究效率低下。

技術(shù)實現(xiàn)思路

[0008]本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題在于如何解決現(xiàn)有的很多體外3D細胞模型的培養(yǎng)都不能很好的模擬人體內(nèi)的細胞復(fù)雜的功能，導(dǎo)致研究效率低下的問題。
[0009]本專利技術(shù)通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)解決上述技術(shù)問題的：
[0010]本專利技術(shù)的第一方面提供一種生物墨水的制備方法，包括以下步驟：
[0011](1)DMEM完全培養(yǎng)基的制備：高糖DMEM培養(yǎng)基中添加抗生素、非必需氨基酸溶液、胰島素、谷氨酰胺、氫化可的松琥珀酸酯和胎牛血清；
[0012](2)水凝膠制備：將一定量的明膠粉末、海藻酸鈉粉末置于紫外燈下照射后，溶解于DMEM完全培養(yǎng)基(H
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DMEM，Gibco)中，然后把懸浮液放到烘箱中，使海藻酸鈉和明膠充分溶解，溶劑完成后高壓蒸汽滅菌，放入培養(yǎng)箱中備用；
[0013](3)細胞懸浮液制備：將HepaRG細胞置于DMEM完全培養(yǎng)基(H
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DMEM，Gibco)中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)HepaRG細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)增殖后，先用移液槍吸出培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)基，用PBS清洗，洗去殘留的培養(yǎng)基，其次加入胰蛋白酶在培養(yǎng)箱內(nèi)消化；待細胞漂浮時，加入DMEM完全培養(yǎng)基(H
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DMEM，Gibco)終止消化；接著，將胰蛋白酶與DMEM完全培養(yǎng)基混合均勻，輕輕吹打從而使細胞從皿底脫落；將混合液體移入離心管，在離心機中進行離心，棄去上清液；再加入層粘連蛋白溶液、纖維蛋白原溶液與DMEM完全培養(yǎng)基進行細胞重懸，得到細胞懸浮液；
[0014](4)生物墨水制備：將步驟(3)獲得的細胞懸浮液與水凝膠混合物混合，吹打，即得。
[0015]有益效果：本專利技術(shù)使用新型生物墨水，即在一定比例的明膠海藻酸鈉混合溶液中加入纖連蛋白、層粘連蛋白一系列生長因子以提高細胞活力。本專利技術(shù)提供了網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，模擬了體內(nèi)肝臟的血管樣通道，營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣可以在網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中進行充分擴散，高度仿生細胞動態(tài)代謝過程與肝臟組織結(jié)構(gòu)。該打印方式可以層層堆疊，依照用戶個性化需求定制
打印結(jié)構(gòu)，為脂肪肝類器官模型的的制備提供新的技術(shù)方案。本專利技術(shù)提出的脂肪肝類器官模型，有效的提升藥物肝毒性評價的可靠性、準確性及全面性，可作為有前景的體外藥物篩選藥物測試平臺。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟(1)中高糖DMEM培養(yǎng)基中添加1％(v/v)抗生素、1％(v/v)非必需氨基酸溶液、5μg/mL胰島素、2mM谷氨酰胺、50μM氫化可的松琥珀酸酯和10％胎牛血清。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟(2)中明膠的終濃度為5％(wt％)，海藻酸鈉的終濃度為1％(w本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種生物墨水的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)DMEM完全培養(yǎng)基的制備：高糖DMEM培養(yǎng)基中添加抗生素、非必需氨基酸溶液、胰島素、谷氨酰胺、氫化可的松琥珀酸酯和胎牛血清；(2)水凝膠制備：將一定量的明膠粉末、海藻酸鈉粉末置于紫外燈下照射后，溶解于DMEM完全培養(yǎng)基中，然后把懸浮液放到烘箱中，使海藻酸鈉和明膠充分溶解，溶劑完成后高壓蒸汽滅菌，放入培養(yǎng)箱中備用；(3)細胞懸浮液制備：將HepaRG細胞置于DMEM完全培養(yǎng)基中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)HepaRG細胞在培養(yǎng)皿內(nèi)增殖后，先用移液槍吸出培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)基，用PBS清洗，洗去殘留的培養(yǎng)基，其次加入胰蛋白酶在培養(yǎng)箱內(nèi)消化；待細胞漂浮時，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化；接著，將胰蛋白酶與DMEM完全培養(yǎng)基混合均勻，輕輕吹打從而使細胞從皿底脫落；將混合液體移入離心管，在離心機中進行離心，棄去上清液；再加入層粘連蛋白溶液、纖維蛋白原溶液與DMEM完全培養(yǎng)基進行細胞重懸，得到細胞懸浮液；(4)生物墨水制備：將步驟(3)獲得的細胞懸浮液與水凝膠混合物混合，吹打，即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物墨水的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中高糖DMEM培養(yǎng)基中添加1％(v/v)抗生素、1％(v/v)非必需氨基酸溶液、5μg/mL胰島素、2mM谷氨酰胺、50μM氫化可的松琥珀酸酯和10％胎牛血清。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物墨水的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中明膠的終濃度為5％(wt％)，海藻酸鈉的終濃度為1％(wt％)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物墨水的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中細胞懸浮液與水凝膠混合物的體積比為1:1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉婧，明紫貝，阮班鋒，唐新宇，彭瑋，
申請(專利權(quán))人：合肥學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：