【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子診斷生物學，具體涉及一種基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
1、登革病毒(dengue?virus，denv)屬于黃病毒科黃病毒屬。denv于1943年首次從日本的人體血液樣本中分離出來，從那時起就根據系統發育分析和抗原表位分析將denv分為四種血清型(denv1-4型)。在中國，四種血清型的denv都引起過登革熱爆發。denv由伊蚊屬的蚊蟲所攜帶并傳染，且埃及伊蚊是denv病毒的主要傳播媒介。中國的登革熱疫情主要是由埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，在適宜的氣候條件下，輸入的denv可能會感染媒介種群。denv感染的癥狀通常包括高燒、頭痛、嘔吐、肌肉和關節疼痛以及皮疹。在一小部分病例中，該疾病會發展為嚴重的登革出血熱或登革休克綜合征，導致患者的高死亡率。但目前，還沒有專門針對登革病毒的疫苗或抗病毒治療藥物。
2、目前，denv病毒的分離和培養是病毒鑒別的一個重要指標，但此法潛伏期長，不適合病毒的快速分離。并且，病毒分離培養只能鑒定活病毒，樣品在運輸過程中需要保持低溫，同時，病毒分離培養非常耗時，樣品病毒含量少，細胞病變往往不明顯，需盲傳多代，病毒種屬也不易判斷。現有技術中建立的elisa方法可以預先對登革熱進行早期診斷，此方法靈敏性高，特異性強，被世界衛生組織推薦為檢測蚊媒病毒的金標準，但該技術必須使用活宿主和活病毒，實驗安全要求高，限制了其在普通實驗室的開展。
3、聚合酶鏈式反應(polymerase?chain?reaction，pcr)是一種被廣泛用于
4、有鑒于此，當前亟需一種新的方法來提高登革熱病毒檢測的靈敏度和準確性。
技術實現思路
1、鑒于
技術介紹
中存在的技術問題，本申請提供了一種基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒及其檢測方法，通過優化熒光探針的設計和檢測流程，顯著提高了檢測的靈敏度和準確性。
2、第一方面，本申請實施例提供了一種基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒，包括多重pcr反應液、登革熱病毒陽性質控和陰性對照；所述多重pcr反應液包括分別用于檢測登革熱病毒i型、登革熱病毒ii型、登革熱病毒iii型、登革熱病毒iv型的四條特異性探針和四對特異性引物。
3、本申請實施例的技術方案中，針對登革熱病毒i-iv型基因，設計了互不干擾的四條特異性探針和四對特異性引物，能夠對登革熱病毒i-iv型進行精準絕對定量分型，提高檢測效率。
4、在一些實施例中，所述四條特異性探針包括：
5、如seq?id?no:1所示的登革熱病毒i型探針：
6、seq?id?no:1：cagttgattgggtcccaaccagc；
7、如seq?id?no:2所示的登革熱病毒ii型探針：
8、seq?id?no:2：tggtgytgccgatcytgcacatt；
9、如seq?id?no:3所示的登革熱病毒iii型探針：
10、seq?id?no:3：tgcggaaccagaaacacccaaca；
11、如seq?id?no:4所示的登革熱病毒iv型探針：
12、seq?id?no:4：accacctttcaatatgctgaaacgcg。
13、該實施例中，通過對登革熱病毒i-iv型基因進行序列比對，篩選保守區域后對溫度、長度、gc值等進行設定，進而設計出分別針對i-iv型基因的四條特異性探針，相比于常規的探針有效提高了特異性，且具有較高的靈敏性。
14、在一些實施例中，所述登革熱病毒i型探針的5’端熒光報告基團為vic，3’端熒光淬滅基團為mgb，具體表示如下：
15、5’-vic-cagttgattgggtcccaaccagc-mgb-3’；
16、所述登革熱病毒ii型探針的5’端熒光報告基團為cy5，3’端熒光淬滅基團為mgb，具體表示如下：
17、5’-cy5-tggtgytgccgatcytgcacatt-mgb-3’；
18、所述登革熱病毒iii型探針的5’端熒光報告基團為fam，3’端熒光淬滅基團為mgb，具體表示如下：
19、5’-fam-tgcggaaccagaaacacccaaca-mgb-3’；
20、所述登革熱病毒iv型探針的5’端熒光報告基團為rox，3’端熒光淬滅基團為mgb，具體表示如下：
21、5’-rox-accacctttcaatatgctgaaacgcg-mgb-3’。
22、該實施例中，通過對各探針的5’端熒光報告基團和3’端熒光淬滅基團進行針對性設計，能夠進一步提高檢測效率和檢測靈敏度。
23、在一些實施例中，所述四對特異性引物包括：
24、如seq?id?no:5所示的登革熱病毒ⅰ型上游引物和如seq?id?no:6所示的登革熱病毒ⅰ型下游引物：
25、seq?id?no:5：ctgttcagccgttccagttg；
26、seq?id?no:6：tcctctatccaaaccctattcca；
27、如seq?id?no:7所示的登革熱病毒ⅰi型上游引物和如seq?id?no:8所示的登革熱病毒ⅰi型下游引物：
28、seq?id?no:7：ttctgcgaaggaaccacagt；
29、seq?id?no:8：gtaccagcatccgtcctcac；
30、如seq?id?no:9所示的登革熱病毒ⅰii型上游引物和如seq?id?no:10所示的登革熱病毒ⅰii型下游引物：
31、seq?id?no:9：gacacacagaagacccacca；
32、seq?id?no:10：atccatggtaagcccacgttt；
33、如seq?id?no:11所示的登革熱病毒ⅰv型上游引物和如seq?id?no:12所示的登革熱病毒ⅰv型下游引物：
34、seq?id?no:11：ccgacaaggacagttctaaa；
35、seq?id?no:12：ggttgatacgcggtttctct；
36、上述序列的標記方式均為5’-3’。
37、該實施例中，基于上述四對特異性引物與四條特異性探針的配合作用，能夠對登革熱病毒i-iv型進行特異性識別，并實現對登革熱病毒i-iv型的準確定量分型，提高檢測效率和檢測靈敏度。
38、在一些實施例中，所述登革熱病毒陽性質控包括陽性對照i、陽性對照ii、陽本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，包括多重PCR反應液、登革熱病毒陽性質控和陰性對照；所述多重PCR反應液包括分別用于檢測登革熱病毒I型、登革熱病毒II型、登革熱病毒III型、登革熱病毒IV型的四條特異性探針和四對特異性引物。
2.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述四條特異性探針包括：
3.根據權利要求2所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒I型探針的5’端熒光報告基團為VIC，3’端熒光淬滅基團為MGB；
4.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述四對特異性引物包括：
5.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒陽性質控包括陽性對照I、陽性對照II、陽性對照III、陽性對照IV；所述陽性對照I為攜帶登革熱病毒I型基因片段的質粒液；所述陽性對照II為攜帶登革熱病毒II型基因片段的質粒液；所述陽性對照I
6.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為無核酸酶水。
7.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述多重PCR反應液還包括2×PerfeCT?qPCR?ToughMix?UNG。
8.一種基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型定量檢測方法，采用權利要求1～7中任一項所述的試劑盒進行檢測，其特征在于，包括如下步驟：
9.根據權利要求8所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型定量檢測方法，其特征在于，所述待檢藥品PCR混合液中，所述待測樣品的體積濃度為20％；登革熱病毒I型探針的濃度為0.2μM，登革熱病毒I型上游引物和下游引物的濃度均為0.2μM；登革熱病毒II型探針的濃度為0.4μM，登革熱病毒II型上游引物和下游引物的濃度均為0.1μM；登革熱病毒III型探針的濃度為0.3μM，登革熱病毒III型上游引物和下游引物的濃度均為0.1μM；登革熱病毒IV型探針的濃度為0.2μM，登革熱病毒IV型上游引物和下游引物的濃度均為0.1μM。
10.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量PCR的登革熱病毒分型定量檢測方法，其特征在于，進行所述PCR擴增時，退火溫度設定為60～63℃。
...【技術特征摘要】
1.一種基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，包括多重pcr反應液、登革熱病毒陽性質控和陰性對照；所述多重pcr反應液包括分別用于檢測登革熱病毒i型、登革熱病毒ii型、登革熱病毒iii型、登革熱病毒iv型的四條特異性探針和四對特異性引物。
2.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述四條特異性探針包括：
3.根據權利要求2所述的基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒i型探針的5’端熒光報告基團為vic，3’端熒光淬滅基團為mgb；
4.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述四對特異性引物包括：
5.根據權利要求1所述的基于多重熒光定量pcr的登革熱病毒分型檢測試劑盒，其特征在于，所述登革熱病毒陽性質控包括陽性對照i、陽性對照ii、陽性對照iii、陽性對照iv；所述陽性對照i為攜帶登革熱病毒i型基因片段的質粒液；所述陽性對照ii為攜帶登革熱病毒ii型基因片段的質粒液；所述陽性對照iii為攜帶登革熱病毒iii型基因片段的質粒液；所述陽性對照iv為攜帶登革熱病毒iv型基因片段的質粒液。
6.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：葉靜，李鑫瑤，曹勝波，溫浩，王旭剛，張晨曦，楊誠潔，錢超男，胡思云，司有輝，朱碧波，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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