【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫學檢測領域，具體的，本專利技術涉及一種選擇性輸血相關多種血細胞抗原的一體式基因分型方法及其應用。
技術介紹
1、人類紅細胞表面血型抗原有362個，聚集在45個血型系統。人類血小板表面具有：abo和rh血型系統抗原、血小板特異性抗原(human?plateletantigen，hpa)、白細胞抗原(human?leukocyte?antigen，hla)和cd36抗原等。而hpa有35種、hla-a、-b和-c蛋白有19252種蛋白、hla-drb1和-dqb1蛋白有3917種。血漿中也有hla表達。臨床輸血中常規紅細胞輸注僅對紅細胞abo和rhd血型抗原進行交叉配型；常規血小板和血漿輸注采用abo和rhd同型輸注，而對血小板表面的hla、hpa和cd36等抗原不進行匹配。在常規輸血配型策略下，輸入非自身抗原的機率較高。研究表明，基于dna測序能夠檢測的血型抗原更廣泛更精確，血型基因匹配的輸血策略可以提高輸血的有效性和安全性，尤其對需要反復用血、疑難配型、有輸血或妊娠史、器官移植和輸注無效等患者具有重要意義。
2、然而在目前的臨床輸血中，常規紅細胞、血小板和血漿輸注僅關注紅細胞abo和rhd血型抗原進行配型，對hpa、hla和cd36等均不進行配型。血清學方法雖然簡單易行且便宜，但無法避免異體抗原的輸入和致敏。而對于那些已經有致敏史(輸血史、妊娠史、器官移植等)、需要反復輸血、血小板輸注無效、自身免疫性疾病、癌癥等患者，這種常規配血策略會帶來非常嚴重的輸血并發癥，不僅不利于原發病的治療，而且可能危及生命
3、在現有技術中，cn113215237a公開了一種hpa和hla抗原系統的同步檢測試劑盒和方法，該方案采用探針捕獲的方法對hpa和hla-a、-b、-c進行分型檢測。為了盡量覆蓋檢測區域，該方案設計了大量探針，并從中不斷優化，最終選擇了多達498條探針，且該方案需要對每例樣本提取的gdna進行機械打斷和再捕獲，操作流程復雜，操作成本貴，不適合大量樣本的分型檢測，并且該專利只檢測了hpa和hla-i類基因。而cn114410758a公開了一種高效高特異性檢測hpa基因型的方法和試劑盒，該方案采用等位基因特異性pcr方法對hpa基因型進行檢測，每個樣本需要用多組引物進行多反應管擴增，操作復雜，且僅對hpa的1～6、15、21等多態性位點進行分型檢測。cn111218514a中公開了一種基于二代測序技術的abo基因全長序列測定方法和試劑包，該方案采用轉座酶的方法對擴增的abo基因進行建庫和ngs測序，操作流程復雜，且轉座酶打斷具有一定的偏好性，此專利僅對abo基因進行分型檢測。綜上，目前尚無涵蓋血型抗原全面、操作簡單、準確率高的基因分型檢測方法。
技術實現思路
1、為了克服常規輸血配型的局限性和現有技術的不足，本申請提供一種針對選擇性輸血相關的紅細胞抗原、血小板抗原和白細胞抗原的基因分型檢測方法，該方法具有覆蓋全、操作簡便，高通量和準確率高等優勢。具體的，本專利技術提供如下的技術方案：
2、本專利技術的第一個方面，提供一種用于針對選擇性輸血相關的基因分型檢測引物組，所述引物組包括如seq?id?no.1-82所示序列。
3、本專利技術的第二個方面，提供一種選擇性輸血相關多種血細胞抗原的一體式基因分型方法，所述方法包括：
4、(4)利用多重pcr擴增在一管中實現多個選擇性輸血相關抗原的編碼基因關注區域的富集；
5、(5)應用上述所富集的核酸片段，進行二代或三代測序文庫構建；
6、(6)對相關血細胞抗原的基因進行分型。
7、其中，所述選擇性輸血相關抗原的編碼基因包括itgb3、gp1ba、gp1bb、itga2b、itga2、cd109、gp9、hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1、abo、fut1、fut2、rhd、rhce和cd36。
8、在一種實施方式中，步驟(1)中所述多重pcr擴增使用的引物混合物為長片段擴增試劑，擴增長度范圍為1kb-35kb，優選2kb-10kb，進一步優選3kb-7kb；長片段擴增試劑能擴增的目的片段的重數范圍為1-500重(pcr產物個數)，優選10-400重，進一步優化為100-200重。
9、在一種優選的實施方式中，所述引物為如seq?id?no.1-82所示序列。
10、在一種實施方式中，所述方法具體包括以下步驟：
11、(1)以提取自樣品的核酸為模板，分別與核苷酸序列如seq?id?no.1～seq?idno.82所示的引物組配制擴增體系，進行第一擴增反應，得第一擴增產物；
12、(2)將第一擴增產物片段化及末端修復補平加a尾；
13、(3)對步驟(2)的產物進行接頭連接后純化；
14、(4)對純化產物進行測序，得到相關血細胞抗原的基因分型結果。
15、具有良好的擴增效率和特異性，且在多重引物擴增時，引物之間不會出現相互干擾的情況。通過調整擴增引物比例，使各基因的關注區域均能達到有效的多重覆蓋，以保證基因分型的準確性。
16、相對于現有技術，本專利技術取得了如下有益的技術效果：
17、1.本專利技術所述的基因分型方法是以dna序列為基礎的涉及輸血相關的多個紅細胞、血小板和白細胞抗原編碼基因的一體式分型方法，可降低同種免疫所致異種抗原致敏率的發生率，促進精準輸血；支持臨床復雜病例輸血配型：適用于需要高度匹配血液產品的復雜病例，如高風險妊娠中胎兒新生兒免疫性血小板減少癥(fnait)和免疫性血小板減少癥患者；
18、2.本專利研發涵蓋的血型基因包括：abo、rhd、rhce、hpa(itgb3、gp1ba、gp1bb、itga2b、itga2、cd109、gp9)、hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1、abo、fut1、fut2等，所覆蓋的等位基因可達幾萬種之多；
19、3.本專利技術方法還可兼顧二代和三代測序優勢：所搭建平臺后續既能進行二代測序文庫構建，也能進行三代測序文庫構建，為將來血型基因中多位點變異的單倍型確認提供了一個優良的再創造和再生產平臺，對將來精準輸血具有重要意義。
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1.一種用于針對選擇性輸血相關的基因分型檢測引物組，其特征在于，所述引物組包括如SEQ?ID?NO.1-82所示序列。
2.一種選擇性輸血相關多種血細胞抗原的一體式基因分型方法，其特征在于，所述方法包括：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述選擇性輸血相關抗原的編碼基因包括ITGB3、GP1BA、GP1BB、ITGA2B、ITGA2、CD109、GP9、HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1、ABO、FUT1、FUT2、RhD、RhCE和CD36。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述多重PCR擴增使用的引物混合物為長片段擴增試劑，擴增長度范圍為1kb-35kb，優選2kb-10kb，進一步優選3kb-7kb；長片段擴增試劑能擴增的目的片段的重數范圍為1-500重(PCR產物個數)，優選10-400重，進一步優化為100-200重。
5.如權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述引物為如SEQ?ID?NO.1-82所示序列。
6.如權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述方
...【技術特征摘要】
1.一種用于針對選擇性輸血相關的基因分型檢測引物組，其特征在于，所述引物組包括如seq?id?no.1-82所示序列。
2.一種選擇性輸血相關多種血細胞抗原的一體式基因分型方法，其特征在于，所述方法包括：
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述選擇性輸血相關抗原的編碼基因包括itgb3、gp1ba、gp1bb、itga2b、itga2、cd109、gp9、hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1、abo、fut1、fut2、rhd、rhce和cd36。
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【專利技術屬性】
技術研發人員：周曉陽，蔡劍平，秦闖華，朱發明，文心美，唐薇，徐根明，張志欣，
申請(專利權)人：北京醫院，
類型：發明
國別省市：
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