一種5’端tRNA半分子檢測方法技術

本項發明專利技術是一種涉及檢測生物或醫學樣品中5′端tRNA半分子的方法。該檢測方法的特征在于其是基于poly(A)加尾、DNA探針雜交、RNase?H消化、反轉錄反應和PCR擴增技術檢測5′端tRNA半分子。本方法可用于生物或醫學樣品中5′端tRNA半分子的檢測分析。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種tRNA半分子(half-tRNA)的檢測方法，本方法可用于tRNA半分子的檢測分析以及臨床標本檢測。?
技術介紹
tRNA將DNA的遺傳密碼翻譯成蛋白質，tRNA在蛋白質生物合成過程中發揮著關鍵性的作用。近年來研究發現tRNA分子還有許多其他的重要生物學功能，特別是在基因表達調控中發揮作用(李盛等.tRNA核質動態分布與細胞命運.生物化學與生物物理進展，2009，36(3)：265-268)。我們在哺乳動物細胞中研究發現血管生成素(angiogenin)是細胞應激狀態下切割生成tRNA半分子的核酸酶，其在tRNA的反密碼子環處對tRNA分子進行切割，生成tRNA半分子，證實了tRNA半分子的生成參與細胞應激反應過程(Fu?H，et?al.Stress?induces?tRNA?cleavage?by?angiogenin?in?mammalian?cells.Febs?Lett，2009,583(2)：437-442)。越來越多的研究已經表明tRNA半分子存在的普遍性，并具有多種潛在的生物學功能(Thompson?DM，et?al.Stressing?out?overtRNA?cleavage.Cell，2009,138(2)：215-219)。特別是在血清中發現了tRNA半分子的廣泛存在(Dhahbi?JM，et?al.5′tRNA?halves?are?present?as?abundant?complexes?in?serum，concentrated?in?blood?cells，and?modulated?by?aging?and?calorie?restriction.BMC?Genomics，2013，14：298)，這表明tRNA半分子可能作為新的信號分子參與生物學過程，并在疾病的發生和發展中發揮重要作用。tRNA半分子將是極有價值的新型疾病檢測的生物標志物分子。因此，建立一種快速、簡便的檢測方法對tRNA半分子的功能研究和臨床檢測均具有重要價值。?由于tRNA半分子只有30nt左右大小，同時細胞和組織中含有大量的全長的tRNA分子，檢測比較困難。目前主要是采用Northern?blot雜交和測序的方法進行檢測，方法繁瑣，耗時長，需要放射性同位素，且不易成功，尤其是不適于臨床大樣本的檢測分析。?
技術實現思路
本專利技術的目的是建立一種檢測5′端tRNA半分子的簡便方法，用于5′端tRNA半分子的檢測，避免放射性同位素的使用。本專利技術的5′端tRNA半分子檢測方法，其特征在于其是基于分離純化的細胞和組織總RNA，經多核苷酸聚合酶在RNA分子3′端進行Poly(A)加尾，再與DNA探針雜交，后經RNase?H消化與DNA探針互補的RNA序列，再由oligo(dT)12-30-錨定引物進行反轉錄獲得cDNA，以5′端tRNA半分子和錨定引物的序列為PCR反應的上下游引物，擴增檢測5′端tRNA半分子。?5′端tRNA半分子檢測方法包括五個主要步驟：(1)tRNA半分子的poly(A)加尾；(2)DNA探針與tRNA分子雜交；(3)RNase?H消化與DNA探針雜交的tRNA序列；(4)由oligo(dT)12-30-錨定引物進行反轉錄反應；(5)PCR擴增反應。DNA探針的長度為13-30個堿基的與待檢測的tRNA分子的3′端序列互補的寡聚DNA分子，其3′端的羥基被修飾，修飾基團可以是磷酸基團或甲氧基等。在反轉錄反應所用引物反轉錄oligo(dT)12-30-錨定引物長度為40-60nt，5′端為20-30nt的錨定序列，3′端為12-30nt的dT，在3′末端加上兩個堿基的(A、G或C)/(A、G、C或T)，最后兩個堿基起錨定作用。PCR擴增使用的上游引物是待檢測5′端tRNA半分子序列的寡聚DNA片段，下游引物是與反轉錄引物的錨定引物片段序列相同的寡聚DNA片段。?為了進行實時定量PCR分析，檢測反應中使用的PCR擴增引物可以進行包括熒光分子、生物素和地高辛等分子的修飾，也可以在PCR反應體系中可以加入熒光染料或分子信標進行實時定量PCR反應。?為了檢測使用方便，可依據本方法組裝成試劑盒使用，試劑盒由RNA加Poly(A)尾反應系統、RNase?H消化系統、反轉錄系統和PCR擴增系統和對應的引物組成，該試劑盒包括：1)多聚核苷酸聚合酶，及其?反應緩沖液；2)RNase?H，雜交用DNA探針，反應緩沖液；3)反轉錄酶，及其反應緩沖液；4)Taq酶，及其反應緩沖液；5)反轉錄oligo(dT)n錨定引物、錨定引物和5′端tRNA半分子擴增用引物。?由于5′端tRNA半分子擴增后DNA片段較小，可用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PCR反應產物。電泳結束后，可以用EB染色和銀染的方法染色觀察。在PCR反應體系中還可以加入內對照引物進行半定量PCR反應，或對PCR引物進行熒光分子標記或加入熒光染料進行實時定量PCR反應分析。?本方法可用于5′端tRNA半分子檢測分析，以及臨床標本的檢驗。?本專利技術用下列實施例進行解釋，這些實施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本專利技術。?結合附圖說明本專利技術的具體實施方法。?圖1：5′端tRNA半分子檢測方法原理示意圖?實施例實施例一?檢測細胞中5′端tRNA半分子?以檢測HeLa細胞中5′half-tRNA-Gly-GCC為例。?1.相關引物設計?(1)5′half-tRNA-Gly-GCC片段：5′-GCATTGGTGGTTCAGTGGTAG-3′，為5′端PCR引物。?(2)tRNA-Gly-GCC的DNA雜交探針：5′-ATTGGCCAGGAATCGAAGCCCGGCCGCCCGC-3′，3′末端磷酸化修飾，用于與tRNA-Gly-GCC3′端雜交。?(3)反轉錄oligo(dT)n-錨定引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)18VN-3′，其中V為A、G或C，N為A、G、C或T。?(4)錨定引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′，為3′端PCR引物。?2.RNA3′端加Poly(A)尾?以HeLa細胞為材料，用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA。取總RNA10μg，分別加入5μl10×Poly(A)聚合酶緩沖液，0.5μl?ATP(10mmol/L)，0.5μl?Poly(A)聚合酶(5000U/ml)(NEB公司)，DEPC水補至50μl，于37℃水浴1小時。然后采用酚-氯仿和乙醇沉淀法純化回收RNA，加入20μl水充分溶解RNA沉淀。?3.特異DNA探針雜交及RNase?H消化?取5μg加尾RNA，即10μl上述RNA產物，加入2.5μl20μmol/L?tRNA-Gly-GCC的DNA雜交特異探針，1.5μl5×反應緩沖液。于70℃5min，后室溫放置5min。再加入1μl?RNase?H(60u/μl，TaKaRa公司)，于30℃反應30mi本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種5′端tRNA半分子檢測方法，該檢測方法的特征在于其是基于分離純化的細胞和組織總RNA，經多核苷酸聚合酶在RNA分子3′端進行Poly(A)加尾，再與DNA探針雜交，后經RNase?H消化與DNA探針互補的RNA序列，再由oligo(dT)12?30?錨定引物進行反轉錄獲得cDNA，以5′端tRNA半分子和錨定引物的序列為PCR反應的上下游引物，擴增檢測5′端tRNA半分子。

【技術特征摘要】
1.一種5′端tRNA半分子檢測方法，該檢測方法的特征在于其是基于分離純化的細胞和組織總RNA，
經多核苷酸聚合酶在RNA分子3′端進行Poly(A)加尾，再與DNA探針雜交，后經RNase?H消化與
DNA探針互補的RNA序列，再由oligo(dT)12-30-錨定引物進行反轉錄獲得cDNA，以5′端tRNA半分
子和錨定引物的序列為PCR反應的上下游引物，擴增檢測5′端tRNA半分子。
2.權利要求1中所述方法包括五個主要步驟：(1)tRNA半分子的poly(A)加尾；(2)DNA探針與tRNA
分子雜交；(3)RNase?H消化與DNA探針雜交的tRNA序列；(4)反轉錄反應；(5)PCR擴增反應。
3.權利要求1中所述的DNA探針的特征在于長度為13-30個堿基的與待檢測的tRNA分子的3′端序列
互補的寡聚DNA分子，其3′端的羥基被修飾，修飾基團可以是...

【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭曉飛，付漢江，劉荻，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11