一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法技術

本發明專利技術公開了一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，通過核酸互補雜交，目標miRNA可以特異性識別與三元探針并形成穩定的三元雜交結構；三元雜交結構中的三元引物沿著三元模板起始鏈置換擴增反應并產生大量的SDA模板產物；SDA模板產物可以打開雙功能發卡探針，最終觸發切口酶信號放大反應，循環酶切分子信標，產生級聯放大的熒光信號。本發明專利技術可以檢測低至100fM的miRNA；該檢測方法具有超高的特異強，能夠很好區分不同錯配位置的高度同源序列，從而解決了現有檢測方法中由于特異性不強而導致假陽性結果的難題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于miRNA檢測
，涉及一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法及試劑盒。
技術介紹
MiRNA是一類細胞內源性非蛋白編碼單鏈RNA分子，其長度約為18～25個堿基，廣泛存在于真核生物中。MiRNA源于胞內miRNA基因的轉錄，整個過程與其它基因的轉錄同步，轉錄產物為由幾百個核苷酸組成的pri-miRNA。Pri-miRNA在核內經過酶切，最終形成帶有發夾結構的前體miRNA（pre-miRNA，約為70個堿基）。之后，pre-miRNA會進入細胞質，并被Dicer酶加工為成熟的miRNA。而成熟的miRNA可與信使RNA（mRNA）的非編碼區作用，形成基因沉默復合物（RNA-induced?silencing?complex，RISC）抑制mRNA的蛋白表達。大量研究表明，超過60%的哺乳動物的編碼基因都受到miRNA的調控。miRNA在細胞的增殖、凋亡、分化以及腫瘤的發病機制中扮演著重要的調控作用，細胞miRNA的表達水平與人類疾病特別是癌癥的發生、轉移密切相關，可以作為標志物用于一些癌癥的早期診斷。由于大部分miRNA分子在細胞內的表達程度比較低、存在多種相似程度極高的同源序列、序列過短等特點，發展高選擇性、高靈敏度、簡單、快速的miRNA檢測方法顯得尤為重要。目前，miRNA的檢測方法仍然以傳統方法包括Northern印跡法、原位雜交法以及基因芯片技術為主，其中Northern印跡法作為miRNA檢測的標準方法被廣泛應用。然而，這些檢測方法的靈敏度較低，選擇性一般，需要多步、耗時反應，洗滌過程繁雜，樣品需求量大。近來，多種基于核酸擴增技術的miRNA檢測方法陸續發展起來，如RT-PCR、RCA、EXPAR等。其中，RT-PCR是研究最多、應用最廣的檢測方法。該方法首先通過特殊引物對miRNA進行反轉錄反應，得到響應的cDNA；在以cDNA為模板進行實時熒光PCR，實現信號的指數擴增。該方法靈敏度高，同時能區分單堿基錯配的同源序列。然而，該方法需要設計復雜的引物，還需要對miRNA進行反轉錄反應；更為重要的是，PCR需要使用昂貴的熱循環儀器。相對于RT-PCR，基于RCA、EXPAR等恒溫擴增技術發展起來的檢測方法更簡單、更直接。然而這些方法存在強烈的非特異性擴增信號，選擇性較差或者耗時長等缺點。因此，發展一種簡單、直接、快速、高靈敏、高選擇性的miRNA檢測方法依舊是一個挑戰。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于提供一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒及方法，以克服現有技術選擇性不高、設計復雜、耗時長等缺點。本專利技術是通過以下技術方案來實現：一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，包括：能夠與miRNA形成三元雜交結構的組合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板，3-WJ引物由兩部分序列組成：其5'端部分與目的miRNA3'端部分互補，3'端部分與3-WJ模板的中間段互補；3-WJ模板由三部分序列組成：其5'端部分與目的miRNA5'端部分互補，中間段與3-WJ引物3'端部分互補，其3'端部分為含核酸切口酶識別位點的SDA模板區域；擴增底物，包括dNTPs混合物；DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板與目的miRNA雜交后觸發DNA分子機器工具，產生SDA模板產物；具有發卡結構的發卡分子H，能夠與SDA模板產物相識別，在識別后雜交打開發卡結構；具有莖環結構的分子信標探針，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，分子信標探針具有能夠與被打開的發卡分子H相互補的序列；以及DNA分子機器擴增反應緩沖液。所述3-WJ引物與3-WJ模板有5～7個堿基的互補，3-WJ引物：3-WJ模板的摩爾比為1:1；發卡分子H與SDA模板產物互補，也與分子信標探針互補，該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發卡探針與分子信標的摩爾比為1:5；DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U。所述反應緩沖液為：50mM?NaCl,10mM?Tris-HCl,10mM?MgCl2,100μg/ml?BSA，pH7.9；反應體積為20μL，反應溫度為37℃，反應時間為30min。所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；SDA模板產物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；發卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，其兩端分別標記有熒光基團FAM和淬滅基團DABCYL。一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法，包括以下步驟：1）通過核酸互補雜交，目標miRNA特異性識別3-WJ引物、3-WJ模板并形成穩定的三元雜交結構；2）將三元雜交結構與擴增底物、DNA分子機器工具、具有發卡結構的發卡分子H、分子信標探針以及DNA分子機器擴增反應緩沖液混合；3）在三元雜交結構存在的情況下，DNA聚合酶識別3-WJ引物與3-WJ模板的SDA模板區域形成的擴增起始位置，并進行擴增，待擴增至一定長度后，擴增產物中的核酸切口酶識別位點被識別并在擴增鏈的相應位點發生切割，產生SDA產物，而三元雜交結構中的SDA模板區域繼續被擴增；4）擴增所獲得的SDA產物觸發打開發卡分子H構成雜交體，發卡結構H被打開后，暴露出的與分子信標互補的區域，從而破壞分子信標的莖環結構，分子信標與雜交體構成雙鏈結構，其熒光恢復；而分子信標參與形成的雙鏈互補結構中還含有核酸切口酶識別位點，在形成雙鏈結構后該位點被識別，并在分子信標序列上進行切割；被切割的分子信標從雙鏈結構上脫落產生熒光信號，而SDA產物與發卡分子H構成的雜交體再打開新的分子信標，以產生更多的熒光信號；5）待達到規定的反應時間后，檢測熒光信號，對熒光信號分析得到待測溶液中miRNA的含量，在一定范圍內，miRNA濃度越高，則熒光信號越強。所述3-WJ引物與3-WJ模板有5～7個堿基的互補，3-WJ引物：3-WJ模板的摩爾比為1:1；發卡分子H與SDA模板產物互補，也與分子信標探針互補，該互補序列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發卡探針與分子信標的摩爾比為1:5；DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U；所述反應緩沖液為：50mM?NaCl,10mM?Tris-HCl,本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，包括：能夠與miRNA形成三元雜交結構的組合物，包括3?WJ引物和3?WJ模板，3?WJ引物由兩部分序列組成：其5'端部分與目的miRNA3'端部分互補，3'端部分與3?WJ模板的中間段互補；3?WJ模板由三部分序列組成：其5'端部分與目的miRNA5'端部分互補，中間段與3?WJ引物3'端部分互補，其3'端部分為含核酸切口酶識別位點的SDA模板區域；擴增底物，包括dNTPs混合物；DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶；SDA模板與目的miRNA雜交后觸發DNA分子機器工具，產生SDA模板產物；具有發卡結構的發卡分子H，能夠與SDA模板產物相識別，在識別后雜交打開發卡結構；具有莖環結構的分子信標探針，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，分子信標探針具有能夠與被打開的發卡分子H相互補的序列；以及DNA分子機器擴增反應緩沖液。

【技術特征摘要】
1.一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，其特征在于，包
括：
能夠與miRNA形成三元雜交結構的組合物，包括3-WJ引物和3-WJ模
板，3-WJ引物由兩部分序列組成：其5'端部分與目的miRNA3'端部分互補，
3'端部分與3-WJ模板的中間段互補；3-WJ模板由三部分序列組成：其5'端
部分與目的miRNA5'端部分互補，中間段與3-WJ引物3'端部分互補，其3'
端部分為含核酸切口酶識別位點的SDA模板區域；
擴增底物，包括dNTPs混合物；
DNA分子機器工具，包括具有鏈置換擴增活性的DNA聚合酶和核酸切
口酶；SDA模板與目的miRNA雜交后觸發DNA分子機器工具，產生SDA
模板產物；
具有發卡結構的發卡分子H，能夠與SDA模板產物相識別，在識別后雜
交打開發卡結構；
具有莖環結構的分子信標探針，其兩端分別標記有熒光基團和猝滅基團，
分子信標探針具有能夠與被打開的發卡分子H相互補的序列；
以及DNA分子機器擴增反應緩沖液。
2.如權利要求1所述的基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，
其特征在于，所述3-WJ引物與3-WJ模板有5～7個堿基的互補，3-WJ引物：
3-WJ模板的摩爾比為1:1；
發卡分子H與SDA模板產物互補，也與分子信標探針互補，該互補序
列中含有Nt.BbvCI的酶切位點；發卡探針與分子信標的摩爾比為1:5；
DNA聚合酶與核酸切口酶的濃度為2.5U和0.8U。
3.如權利要求1所述的基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑盒，
其特征在于，所述反應緩沖液為：50mM?NaCl,10mM?Tris-HCl,10mM?MgCl2,
100μg/ml?BSA，pH7.9；反應體積為20μL，反應溫度為37℃，反應時間為

\t30min。
4.如權利要求1或2所述的基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測試劑
盒，其特征在于，所述的3WJ-模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
3WJ-引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
SDA模板產物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
發卡分子H的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
分子信標探針的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，其兩端分別標記有熒
光基團FAM和淬滅基團DABCYL。
5.一種基于級聯恒溫擴增的miRNA熒光檢測方法，其特征在于，包括
以下步驟：
1）通過核酸互補雜交，目標miRNA特異性識別3-WJ引物、3-WJ模板
并形成穩定的三元雜交結構；
2）將三元雜交結構與擴增底物、DNA分子機器工具、具有發卡結構的
發卡分子H、分子信標探針以及DNA分子機器擴增反應緩沖液混合；
3）在三元雜交結構存在的情況下，DNA聚合酶識別3-WJ引物與3-WJ
模板的SDA模板區域...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙永席，陳鋒，張青，田苗，趙越，林曼麗，
申請(專利權)人：西安交通大學，
類型：發明
國別省市：陜西;61