本發明專利技術將一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因TIR2轉入植物并使得這種轉基因植物能夠具備增加植物抗寒性的作用。所述冷休克蛋白基因TIR2含756個堿基，編碼的氨基酸251個；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。本發明專利技術中來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因采用人工方法合成，轉基因植物具備較高的抗寒性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因的序列，利用農桿菌將該基因轉化到植物中，使植物抗凍能力得到提高。
技術介紹
植物對環境變遷及不良環境有足夠的適應性和抵抗能力，這種抗逆性既受系統進化的遺傳基因型所控制，又受系統發育中生理生態因素所制約。逆境會誘導植物表達大量的特異蛋白，不同的逆境誘導表達的蛋白不完全相同，既有交叉又有差別，而同一種逆境在同一種植物的不同部位所誘導表達的蛋白也不完全相同，在不同的植物物種中這些蛋白的合成差別就更大(Kasuga?et?al.，Nature?Biotechnol.，1999，17：287-291)。因此有很多的蛋白參與了植物對非生物逆境的反應，它們協同作用來調整植物生理代謝的變化，從而提高植物對非生物逆境的適應性，可見植物對非生物逆境的抵抗是體內的系統反應，并不是由一個兩個功能基因就能完成的(Urrutia?et?al.，Biochem.Biophy.Acta.，1992，1121：199-206)。逆境脅迫導致植物體內產生多方面的變化：如抗逆基因的表達，新蛋白質的合成，代謝的轉變，抗逆境物質的積累，氣孔的關閉，光合作用的降低等(Smirnoff，Curr.Opin.Biotech.，1998，9：214-219)。人們就逆境對植物影響的認識和研究，首先是從表觀生理指標一般性描述開始，其次研究植物在各種逆境下產生的生理生化、生態變化和生理調節機制，>最后發展到分子水平，進一步探討植物對不同逆境的感應、信號傳導、基因表達與調控、蛋白質組裝和細胞膜功能獲得。為更深入了解植物對不同逆境響應的分子機理和研究人工調控的生物技術等方面展示出良好前景。溫度作為重要的環境因子之一，限制植物的分布、生長和產量(Viswanathan?et?al.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol?Sci.，2002，357(1423)：877-886)。在研究中人們發現植物在長期的進化中發展了許多對溫度逆境的適應能力。但目前對植物這種冷適應的機理還不是十分清楚，因此探索植物抗寒性的遺傳機理不僅在基礎理論上具有重要意義，在解決生產實際問題上也具有廣泛的應用價值。本項專利技術利用PTDS法合成了來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，將該基因轉化擬南芥，進而提高了轉基因擬南芥的抗凍能力，該類基因對于培育植物抗低溫的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現實意義。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于將一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因轉入植物體內，并對該轉基因植物進行功能驗證，以證明它具有提高植物的抗凍性的功能。一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。所述來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因長756bp，編碼的氨基酸251個。所述來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因通過農桿菌介導轉入擬南芥，應用于植物抗凍性。所述來源于短桿菌的丙烯酰胺降解酶基因采用人工方法合成，具體包括以下步驟：1)冷休克蛋白TIR2的人工合成依照PTDS(PCR-based?two-step?DNA?synthesis，PTDS)方法進行源自短桿菌的丙烯酰胺降解酶基因進行化學合成，在保持TIR2基因的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成了冷休克蛋白TIR2基因。2)TIR2農桿菌雙元載體的構建TIR2基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎上構建而成，在pCAMBIA-1301載體的多克隆位點處插入兩端附加了煙草的染色質附著SAR序列的外源基因的表達單元，這有利于轉基因的穩定遺傳；在外源基因的表達單元內，我們在目的基因的兩側導入了BamHI和Sacl酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV355啟動子+TMV?omega?leader?sequence控制3)電擊法轉化農桿菌參照MicroPulserTM?Electroporation?Apparatus?Operating?Instructions?and?Application?Guide(BIO-RAD公司)制備農桿菌GV3101感受態.并且將構建好的農桿菌雙元載體經電擊法轉入到農桿菌中。4)農桿菌介導轉化擬南芥利用蘸花法將構建好的農桿菌轉入擬南芥體內.首先將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3～5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22℃培養室，低光強度下生長24小時，即可正常培養。生長約兩個月后，收集種子，4℃冰箱貯存待用。5)擬南芥轉化植株種子的篩選將得到的種子進行篩選，包括GUS組織化學染色分析和轉基因陽性植株的PCR檢測得到轉入TIR2基因的擬南芥。6)轉基因擬南芥抗凍性驗證將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22℃生長兩個星期。然后將野生型和轉基因培養皿小苗用于低溫抗性實驗。將野生型和轉基因培養皿小苗在4℃冰箱下培養48小時，然后放到-20℃冷凍30min，然后再放回4℃冰箱放置過夜恢復，第二天再放回培養室恢復培養。結果表明，野生型和轉基因擬南芥培養皿小苗的存活率有很大的差異。本專利技術實現的有益效果本專利技術采用PTDS法合成了來源于釀酒酵母的冷休克蛋白TIR2基因，為了進一步分析該基因在低溫逆境中的作用與功能，我們比較了轉TIR2基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性。結果表明，野生型和轉TIR2基因擬南芥植株在存活率上有很大的差異，轉基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這也表明TIR2的轉入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。附圖說明圖1是用于擬南芥轉化的植物表達載體示意圖。圖2是獲得的轉TIR2基因擬南芥的GUS染色圖。圖3是轉TIR2基因擬南芥與野生型擬南芥的抗凍表型圖。具體實施方式以下結合附圖詳細描述本專利技術的技術方案。應當說明的是，所述實施例僅用以說明本專利技術的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本專利技術進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對專利技術的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本專利技術技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本專利技術的權利要求范圍中。本專利技術所用的試驗材料及其來源包括：野生型擬南芥(Arabidopsis?thaliana)生態型擬南芥Columbia，23℃人工氣候室本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如
SEQ?ID?NO?1所示。
2.根據權利要求1所述的來源于釀酒酵母的冷休克蛋白基因，其特征在于，
其氨基酸序列如SEQ?ID?NO?2所示。
3.權利要求1或2所述的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周惠，苗輝，蔣海燕，張楊，蔣小輝，
申請(專利權)人：無錫柏歐美地生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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