玫瑰功能基因RrFLS1在調控植物類黃酮代謝中應用制造技術

本發明專利技術屬于植物基因工程技術領域。具體涉及一種玫瑰功能基因RrFLS1在調控植物類黃酮代謝中的應用。分離得到玫瑰花色功能基因RrFLS1，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其對應的蛋白質的序列如SEQ?ID?NO：2所示。轉化試驗表明：該基因能夠改變植物特別是煙草的花色，提高植物類黃酮的含量。將該基因轉化煙草，使轉基因植物的花色發生改變，類黃酮含量增加，轉基因煙草花瓣顏色由粉紅色變成白色。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物基因工程
具體涉及一種玫瑰功能基因RrFLS1片段的分離克隆、功能驗證和應用。所述的基因與植物類黃酮代謝有關。將該基因的完整翻譯區與花椰菜花葉病毒啟動子結合后直接轉入一般植物體，轉基因植株的花色發生變化,類黃酮含量也增加了。
技術介紹
類黃酮（Flavonoids)是一類在植物中廣泛存在被研究最深入的多酣類次生代謝產物，目前發現的大約有6000多種（喬小燕等，2009)。類黃酮在植物界分布最多的是被子植物，種類最全，含量較高；大量研究證實類黃酮化合物是一種強活性氧自由基清除劑，它可以通過抗自由基活性、抗氧活性、抗脂質氧化活性和金屬螯合活性而發揮抗氧化活性（Benavente,1993;Bombardelli?and?Morazzoni,1993)。國內報道沙棘總黃酮、槲皮素、盧丁、甘草黃酮、燈蓋花素等都具有不同程度抗氧化作用（孟申等，1992)。目前已經發現多種具有抗癌功能的類黃酮物質，如山奈素、槲皮素和楊梅酮等類黃酮，可以通過誘導細胞調亡發揮抗癌功能（Kampa?era,2007)；國內外科研工作者發現類黃酮化合物具有降血脂、膽固醇的作用，還具有抑制血栓和擴張冠狀動脈的功能，因此可以用于治療心腦血管系統的一些疾病。玫瑰(Rosa?rugosa?Thunb.)是薔薇科薔薇屬落葉叢生灌木，花型秀美，芳香四溢，色彩絢麗，在中國傳統名花中評價極高，素有“花中皇后”之稱。玫瑰具有重要的經濟價值,其花瓣葉片含有多種類黃酮物質，應用于醫療、保健等。目前尚未見玫瑰功能基因RrFLS1在調控植物類黃酮代謝中的應用的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種分離的玫瑰功能基因RrFLS1，本專利技術的目的還涉及該基因在調控植物類黃酮合成中的應用，所述的基因與花色的形成相關。本專利技術提供了玫瑰中表達RrFLS1的基因編碼序列及其功能，具體包括：RrFLS1基因的核苷酸編碼序列的克隆，表達載體的構建，以及將該基因轉化宿主煙草，對轉基因煙草植株進行分子鑒定和表型觀察，以評估該基因在在調控植物類黃酮代謝中的應用的前景。本專利技術通過以下技術方案實現：首先從玫瑰中克隆出RrFLS1功能基因。該基因片段為具有特定序列的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其開放閱讀框（編碼區）為1008bp。本專利技術還提供了這種玫瑰RrFLS1蛋白編碼序列，它有335個氨基酸殘基，其對應的蛋白質的序列如SEQ?ID?NO：2所示。本專利技術還提供了用于調取獲得玫瑰樣品中基因RrFLS1的一對核苷酸引物。該引物對根據基因RrFLS1設計，使用該對引物對玫瑰花瓣樣品cDNA進行PCR擴增可獲得1008bp的基因片段。所述引物對的DNA序列如下所示：P1正向引物:5’ATGGGGGTAGAGAGAGTTCAAG?3’(序列見序列表SEQ?ID?NO：3)；P2反向引物:5’TTACTGGGGGATCTTGTTGA?3’(序列見序列表SEQ?ID?NO：4)。本專利技術還提供了一對用于檢測玫瑰RrFLS1基因在轉基因煙草中表達的核苷酸的引物對。該引物對根據基因RrFLS1設計，使用此對引物對轉化該基因的煙草樣品cDNA進行RT-PCR擴增,檢測該基因是否在轉基因煙草中表達，可獲得176bp的基因片段。該引物對的DNA序列如下所示：P3正向引物:5’TGGAGGGATACGGAACATTTTTA?3’(序列見序列表SEQ?ID?NO：5)；P4反向引物:5’CACCACCTTGTGTAGATTCTTTGC?3’(序列見序列表SEQ?ID?NO：6)。可利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，例如可以通過直接DNA轉化、電導、農桿菌介導等常規生物技術方法將本專利技術提供的RrFLS1的編碼基因導入植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。使用本專利技術的基因片段構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前面可加上任意一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或者植株進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入具有抗性的抗生素標記物（例如卡那霉素或潮霉素等）。被轉化的宿主是包括煙草在內的多種植物，培育不同花色的植物種類。與本專利技術的配套的，本專利技術還提供了一種轉基因煙草代謝物提取方法，這對于全面理解本專利技術的技術方案是有益的。方法是準確稱取0.5g轉基因煙草植株的葉片和花瓣，加入2.5mL提取液（甲醇︰鹽酸︰水體積比=70︰0.1︰29.9）于黑暗條件下4℃浸提24h，期間每隔6h用旋轉振蕩器振蕩1min。12000rpm離心10min，取上清至新的離心管中，再用孔徑0.22μm的尼龍微孔濾器過濾后，保存于–40℃冰箱中，用于花青苷與其他類黃酮的HPLC-DAD分析。本專利技術的配套方法還提供了一種轉基因煙草植株中類黃酮代謝物檢測方法。具體是：使用日本島津公司生產的“島津液相系統”進行定性分析，步驟包括：LC-20AT型二元梯度泵，SIL-20AC自動進樣器，CTO-20AC色譜柱控溫箱，SPD-20AC檢測器,LC-Solution工作站；色譜柱為日本Tosoh株式會社生產的TSK?gel?ODS-80Ts?QA反相硅膠柱（4.6mm×250mm，粒徑5μm，日本Tosoh株式會社）。分析條件：流速0.8mL·min-1，柱溫35℃，進樣體積10μL，200～800nm范圍內全波長掃描吸收光譜，在520nm和360nm波長下一次性同時檢測花青苷和花黃素。流動相組成為：A相，10%甲酸超純水（體積比）；B相，乙腈。分析時間35min。梯度洗脫程序為：0min，90%A，10%B；20min，70%A，30%B；25min，90%A，10%B。附圖說明序列表SEQ?ID?NO:1是本專利技術分離克隆的包含有RrFLS1基因編碼區的DNA片段（其中1-1008bp為CDS）。序列全長為1008bp，編碼335個氨基酸。序列表SEQ?ID?NO:2是上述RrFLS1基因片段對應的蛋白質的序列。序列表SEQ?ID?NO:3，SEQ?ID?NO:4是擴增上述玫瑰花瓣樣品cDNA的引物對的DNA序列。序列表SEQ?ID?NO:5，SEQ?ID?NO:6是檢測轉基因煙草中表達基因片段引物對的DNA序列。圖1：是原始超量植物表達載體pCAMBIA2300s結構示意圖（載體大小為11630bp）。圖2：對照早花煙草與轉化RrFLS1基因的早花煙草的花色比較圖。圖中：圖2A是對照早花煙草花色；圖2B是本專利技術轉RrFLS1早花煙草的花色本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示的玫瑰功能基因RrFLS1在調控植物類黃酮代...

【專利技術屬性】
技術研發人員：寧國貴，羅平，包滿珠，王楨，肖曉，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：