一種下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體及其應(yīng)用，所述的載體為含miR-7-sponge（海綿）核苷酸序列的真核表達(dá)載體。本發(fā)明專利技術(shù)的載體不僅可以方便、快速、長效地下調(diào)miR-7的表達(dá)，同時(shí)還可快捷地觀察miR-7下調(diào)表達(dá)后的生物學(xué)效應(yīng)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)專利涉及一種下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體及其應(yīng)用，尤其用于長效抑制其活性。
技術(shù)介紹
微小RNA-7（microRNA-7，miR-7）具有重要的生物學(xué)作用。目前，改變miR-7的表達(dá)，從而研究其生物學(xué)功能的技術(shù)主要有反義核酸（Antisense?oligonucleotides，ASO）、抑制劑（Inhibitor）和Antagomir等。然而，這些方法存在有效作用時(shí)間短、長時(shí)間作用效果較差等缺點(diǎn)，難以達(dá)到體內(nèi)長效穩(wěn)定下調(diào)miR-7表達(dá)的效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服現(xiàn)有下調(diào)miR-7表達(dá)技術(shù)的局限性，本專利技術(shù)專利提供了一種新的下調(diào)方法。該方法設(shè)計(jì)簡單，操作容易，不僅適于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，也可用于整體水平轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是：利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建含miR-7-sponge（海綿）的真核表達(dá)載體。將該載體體外轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，利用熒光定量PCR儀檢測miR-7成熟體的表達(dá)，同時(shí)通過體外實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)miR-7表達(dá)后的生物學(xué)效應(yīng)。本專利技術(shù)一方面涉及一種下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體，所述的載體為含miR-7-sponge（海綿）核苷酸序列的真核表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述的miR-7-sponge（海綿）核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1.本專利技術(shù)另一方面還涉及上述下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：合成miR-7-sponge序列；用HindⅢ/KpnI雙酶切骨架載體pEGFP-C2和miR-7-sponge序列，回收片段純化，連接后轉(zhuǎn)化，接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒載體。在本專利技術(shù)的另一方面，本專利技術(shù)還涉及上述下調(diào)微小RNA-7表達(dá)載體在下調(diào)微小RNA-7表達(dá)中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的下調(diào)是在離體細(xì)胞中進(jìn)行；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的離體細(xì)胞是人肺癌細(xì)胞。本專利技術(shù)的載體不僅可以方便、快速、長效地下調(diào)miR-7的表達(dá)，同時(shí)還可快捷地觀察miR-7下調(diào)表達(dá)后的生物學(xué)效應(yīng)。附圖說明圖1：表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，miR-7表達(dá)水平檢測。圖2：表達(dá)載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，miR-7生物學(xué)效應(yīng)檢測，（A，光鏡；B，MTT實(shí)驗(yàn)），圖中：MCS,多克隆位點(diǎn)（Multiple?clone?sites）;SV40，猴空泡病毒40（Simian?virus40）；EGFP，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced?green?fluorescent?protein）；Kanr，卡那霉素抗性（Kanamycin?resistance）；HSV，單純皰疹病毒（Herpes?simplex?virus)；Puc?Ori,復(fù)制起始位點(diǎn)（origin?of?replication）;Pcmv，人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（Human?cytomegalovirus?promoter）；具體實(shí)施方式：合成miR-7-sponge序列：5’-AAGCTTA?ACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCACGCGAACAAAATCGAGGTCTTCCA-3’。最后在5’端加上HindⅢ酶切位點(diǎn)，3’端加上KpnI酶切位點(diǎn)。miR-7-sponge序列設(shè)計(jì)完成。用HindⅢ/KpnI雙酶切骨架載體pEGFP-C2（商購）、目的片段miR-7-sponge，回收片段純化，16℃過夜連接。連接后轉(zhuǎn)化，挑取4個(gè)菌落，接種到含10μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和KpnI雙酶切后，電泳鑒定，并測序，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-C2-miR-7-sponge，命名為pG-miR-7-Sp（對(duì)應(yīng)的pEGFP-C2命名為eGFP-Control），如圖2所示。將質(zhì)粒pG-miR-7-Sp大量抽提后，鑒定純度和濃度。結(jié)果顯示，OD260/280=1.76，濃度為128mg/L，-80℃保存；常規(guī)培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株95D細(xì)胞，按3×105/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板中，將10ug質(zhì)粒pG-miR-7-Sp和對(duì)照質(zhì)粒eGFP-Control（pEGFP-C2）體外分別利用Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。48小時(shí)后，抽取各組細(xì)胞總RNA，利用Realtime?PCR探針法檢測miR-7表達(dá)水平。結(jié)果顯示，pG-miR-7-Sp轉(zhuǎn)染組中，miR-7表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖1），提示該載體可以顯著下調(diào)miR-7的表達(dá)。進(jìn)一步檢測了各轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞生長的變化，如圖2所示，培養(yǎng)72小時(shí)后，與eGFP-Control轉(zhuǎn)染組相比，pG-miR-7-Sp載體轉(zhuǎn)染組中95D細(xì)胞的生長明顯增強(qiáng)（p<0.05），提示miR-7表達(dá)水平下調(diào)后，可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體外生長，結(jié)果表明，含miR-7-sponge真核表達(dá)載體不僅可以下調(diào)miR-7在真核細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)，也可通過體外轉(zhuǎn)染觀察miR-7下調(diào)表達(dá)后的生物學(xué)效應(yīng)。以上所述是本專利技術(shù)的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本專利技術(shù)所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體，所述的載體為含miR-7-sponge（海綿）
核苷酸序列的真核表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述的miR-7-sponge（海綿）核苷酸序列
為SEQ?ID?NO.1；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的載體具有SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序
列。
2.權(quán)利要求1所述的下調(diào)微小RNA-7表達(dá)的載體的構(gòu)建方法，其特征在于包
括如下步驟：合成miR-7...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：徐林，李永菊，周涯，陶弋婧，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：遵義醫(yī)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：