具有快速加工性能的經(jīng)過修飾的酸性α葡糖苷酶制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種修飾的人酸性α-葡糖苷酶多肽，其在N端70kDa加工位點(diǎn)處或其附近具有增加的疏水性，以及制造和使用該修飾的人酸性α-葡糖苷酶治療糖原貯積癥(glycogen?storage?disorder)的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】【專利摘要】本專利技術(shù)提供了一種修飾的人酸性α-葡糖苷酶多肽，其在N端70kDa加工位點(diǎn)處或其附近具有增加的疏水性，以及制造和使用該修飾的人酸性α-葡糖苷酶治療糖原貯積癥(glycogen?storage?disorder)的方法?！緦＠f明】具有快速加工性能的經(jīng)過修飾的酸性Cl葡糖苷酶本申請(qǐng)要求獲得于2011年4月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)N0.61/478，336的優(yōu)先權(quán)，本文通過引用并入其全部?jī)?nèi)容。本公開一般地涉及經(jīng)過修飾的人酸性α葡糖苷酶及其在治療糖原貯積病中的使用。蓬佩病，也稱作2型糖原貯積病(GSD)和酸性麥芽糖酶缺陷，是一種由于一種溶酶體酶——酸性α葡糖苷酶(GAA)缺陷導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳代謝性肌病。GAA是一種1，4和1，6-α -外切葡糖苷酶，在溶酶體中將糖原水解為葡萄糖。GAA缺陷導(dǎo)致糖原在溶酶體中積累，造成呼吸肌、心肌和骨骼肌進(jìn)行性損傷。病情的范圍從急進(jìn)性嬰兒期病程，其通常導(dǎo)致1-2歲前死亡，到進(jìn)行更緩慢的、更不均一的病程，其在孩童和成年中造成顯著的發(fā)病和早夭。Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,3:3389-3420(2001, McGraw-Hill);Van der Ploeg and Reuser, Lancet372:1342-1351 (2008)。GAA的生物合成、靶定和溶酶體加工中涉及的步驟是復(fù)雜的。人GAA的初級(jí)翻譯產(chǎn)物是一種952個(gè)氨基酸的多肽，含有7個(gè)共有的N-糖基化位點(diǎn)。Moreland et al., J.Biol.Chem.280:6780-6791(2005)。GAA上的N-聚糖(N-glycan)包括復(fù)雜的和高甘露糖型聚糖，其中一些被甘露糖-6-磷酸修飾。GAA通過不依賴陽(yáng)離子的甘露糖-6-磷酸受體被靶定到溶酶體。在溶酶體中，該酶被蛋白酶和糖苷酶進(jìn)一步加工，產(chǎn)生具有提高的糖原清除能力的成熟肽。圖1顯示了 GAA加工 通路的示意圖。Moreland et al.，2005。典型地，GAA在加工期間經(jīng)歷最多4個(gè)剪切事件。首先，初級(jí)GAA翻譯產(chǎn)物在57位氨基酸左右被剪切，形成一個(gè)表觀分子量為100-110-kDa的前體。接著，100-110-kDa的前體在113和122位氨基酸周圍被剪切，形成一個(gè) 3.9-kDa (aa78-113)和一個(gè) 95_kDa (aal22_952)部分。然后，該 95_kDa多肽在781和792位氨基酸左右被剪切，產(chǎn)生76-kDa(aal22-781)和19.4-kDa (aa792-952)的片段。該76-kDa種類仍然與19.4-和3.9-kDa多肽保持關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的一個(gè)蛋白水解切割將76-kDa種類變成70-kDa (aa204-781)種類，其仍然與19.4_，10.4_，和3.9-kDa多肽保持關(guān)聯(lián)。當(dāng)前用于治療蓬佩病的人用療法涉及施用重組人GAA(例如ΜΥ0ΖΥΜΕ?)。盡管重組人GAA可有效減少患者體內(nèi)糖原的積累，但是其在施用時(shí)不會(huì)被完全加工成70-kDa形式。因?yàn)镚AA對(duì)糖原的親和力可能會(huì)由于蛋白酶的加工而顯著提高(Moreland etal.，2005; Wisselaar et al.，J.Biol.Chem.268:2223-2231 (1993))，所以提高重組人 GAA的加工速度可能為增加GAA的治療效力，包括降低GAA療法的劑量和/或減少施用頻率，提供條件。因此，我們?cè)谶@里描述修飾的GAA多肽，其與未修飾的人GAA相比可以被更加快速地加工。某些實(shí)施方案包含在N-端70-kDa加工位點(diǎn)或N-端70_kDa加工位點(diǎn)附近具有修飾的人酸性α葡糖苷酶或其催化活性片段。在一些實(shí)施方案中，提供這樣的多肽，其包含在N-端70-kDa加工位點(diǎn)或N-端70-kDa加工位點(diǎn)附近具有修飾的人酸性α葡糖苷酶(GAA)或其催化活性片段。所述催化活性片段可選自70-kDa，76-kDa，82-kDa，95-kDa或任何其它催化活性片段。在某些實(shí)施方案中，多肽還包含受體靶定序列。在一些實(shí)施方案中，受體靶定序列是IGF2序列。在某些情況下，修飾導(dǎo)致N-端70-kDa加工位點(diǎn)或其附近的疏水性增加。在一些情況下，多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的195-209位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處被修飾。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，修飾位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的200-204位的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，修飾位于相當(dāng)于SEQ IDN0:1的201位的氨基酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，修飾是用更疏水的氨基酸替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，修飾是插入一個(gè)或多個(gè)更疏水的氨基酸。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，疏水氨基酸選自亮氨酸和酪氨酸。在某些實(shí)施方案中，多肽與SEQ ID NO:1的至少500個(gè)氨基酸有至少80%同一性。在一些情況下，多肽與SEQ ID NO:1的至少500個(gè)氨基酸有至少90%同一性。在其它情況下，多肽與SEQ ID NO:1的至少500個(gè)氨基酸有至少95%同一性。在某些實(shí)施方案中，多肽與未修飾的人酸性α葡糖苷酶相比顯示更迅速的溶酶體蛋白酶加工。在一些實(shí)施方案中，多肽在施用20個(gè)小時(shí)后有至少50%被蛋白水解加工成70-kDa形式。在其它實(shí)施方案中，多肽在被施用55個(gè)小時(shí)之內(nèi)基本上全部被蛋白水解加工成70-kDa形式。一些實(shí)施方案包括與包含至少一個(gè)甘露糖-6-磷酸的寡糖綴合的多肽。在某些實(shí)施方案中，提供了一種編碼修飾的GAA多肽的核酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了一種被該核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞能夠分泌修飾的GAA。在某些實(shí)施方案中·，提供了一種減少或防止糖原在組織中積累的方法，包括向有此需要的患者施用有效量的如本文中描述的多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，患者患有糖原貯積病。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，糖原貯積病是蓬佩病。在其它實(shí)施方案中，提供了一種治療糖原貯積病的方法，包括向有此需要的患者施用治療有效量的修飾GAA。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，糖原貯積病是蓬佩病。在其它實(shí)施方案中，提供了一種適用于治療糖原貯積病的藥物組合物，其包括如本文中描述的修飾GAA。在一些實(shí)施方案中，該多肽是凍干的。附圖簡(jiǎn)要說明圖1的圖示顯示了天然人GAA的成熟的模型。圖2顯示了重組GAA(泳道I)、人胎盤GAA(泳道2)和牛睪丸GAA(泳道3)的SDS-PAGE。圖3A顯示了人GAA氨基酸197-206與來自小鼠、倉(cāng)鼠、牛和鵪鶉GAA的比對(duì)結(jié)果。圖3B顯示了不同的經(jīng)加工的GAA的Western印跡的比較結(jié)果。泳道I顯示了從胎盤純化的人GAA。泳道2和3是從用野生型人GAA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中純化的對(duì)照GAA。泳道4-7是從用人GAA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中純化的修飾GAA，該GAA構(gòu)建體中的第201位氨基酸組氨酸被改變成精氨酸(泳道4)、亮氨酸(泳道5)、酪氨酸(泳道6)和賴氨酸(泳道7)。圖4顯示了 rhGAA(H201L)和rhGAA(WT)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞中的生物合成。圖5顯示了蓬佩病成纖維細(xì)胞(Pompe fibroblast)攝取和加工rhGAA(WT)和rhGAA(H201L)。圖6顯示了用抗本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種多肽，由在N?端70?kDa加工位點(diǎn)處或其附近具有修飾的人酸性α?葡糖苷酶或其催化活性片段組成。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：WM坎菲爾德，RJ莫雷蘭，工藤麻里子，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：建新公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：美國(guó);US