本發明專利技術公開了一種檢測結核分枝桿菌特異性免疫應答的試劑及其用途。通過γ干擾素釋放實驗和血清酶聯免疫方法，公開了一種結核桿菌免疫陽性試劑Rv0733，包括抗原或多肽及其類似物，用于檢測結核病患者特異性細胞免疫和體液免疫應答水平。用本發明專利技術試劑免疫小鼠后，小鼠能產生特異性的γ干擾素等細胞因子及抗體。利用本發明專利技術體外刺激結核病人或正常人群T細胞，檢測γ干擾素釋放細胞的數量或培養上清中γ干擾素含量，能區分結核病人及正常人群；通過檢測外周血清中抗本發明專利技術的特異性抗體的水平，可提高結核病患者的檢測靈敏度和特異性；利用跟蹤結核病患者治療過程中Rv0733特異性免疫應答對比實驗，能揭示結核病人的臨床預后情況。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了。通過γ干擾素釋放實驗和血清酶聯免疫方法，公開了一種結核桿菌免疫陽性試劑Rv0733，包括抗原或多肽及其類似物，用于檢測結核病患者特異性細胞免疫和體液免疫應答水平。用本專利技術試劑免疫小鼠后，小鼠能產生特異性的γ干擾素等細胞因子及抗體。利用本專利技術體外刺激結核病人或正常人群T細胞，檢測γ干擾素釋放細胞的數量或培養上清中γ干擾素含量，能區分結核病人及正常人群；通過檢測外周血清中抗本專利技術的特異性抗體的水平，可提高結核病患者的檢測靈敏度和特異性；利用跟蹤結核病患者治療過程中Rv0733特異性免疫應答對比實驗，能揭示結核病人的臨床預后情況。【專利說明】
本專利技術屬于生物醫學檢驗領域，具體涉及一種用于檢測結核分枝桿菌特異性免疫應答的試劑及其用途。
技術介紹
結核病是全球三大傳染性疾病之一，2011年，WHO估測中國結核病總病例140萬人，占全球1200萬總病例中的11.67%，僅次于印度的310萬(25.83% )，位居全球第二，其中新發病例91.2萬，死亡4.7萬人。結核病給我國造成了巨大經濟和社會負擔。隨著研究的不斷深入，結核病的臨床診斷方法有了較大的發展，但是在診斷的特異性和敏感性方面還存在一定不足，需要加以改進。免疫學檢測方法是現階段檢測結核分枝桿菌感染的重要輔助方法之一，其中以抗原特異性刺激后的Y干擾素釋放實驗(IGRA)為主。現有的商業試劑盒有T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-1T。其中，T-spot.TB使用的抗原是 ESAT-6 和 CFP-10，而 QuantiFERON(QFT) -1T 使用的抗原是 ESAT-6、CFP_10 和 TB7.7。這些抗原都由結核分枝桿菌特異性的RD (Region of Difference)區基因編碼,能較好地避免已接種的BCG (卡介苗)的干擾。然而，現有報道表明ESAT-6，CFP-10和TB7.7等基因主要表達于結核分枝桿菌的早期感染階段，而且其他非結核分枝桿菌類的M.kansasii, M.szulgai, M.marinum或M.gordonae等也表達ESAT-6，CFP-10或TB7.7，所以當患者感染此類細菌時會出現結果的假陽性。而且已有文獻表明我國人群存在較嚴重的非結核分枝桿菌感染情況，所以T-spot.TB和QuantiFERON(QFT)-1T在我國結核病診斷應用中的效果不理想，表現為其檢測的敏感性和特異性介于80% — 90%之間，而且這二個試劑盒在結核病的臨床預后跟蹤后的檢測價值較差。因此新的T細胞反應性抗原的篩選，是提高結核病患者的診斷準確性及臨床預后觀察的新策略。人體在感染結核分枝桿菌后，體內會產生結核分枝桿菌特異性T細胞。體外用相同的抗原再次刺激機體T細胞時，能檢測到大量的Y干擾素等細胞因子或分泌細胞因子的細胞，從而能區分出正常健康人和被結核分枝桿菌感染的人群。在臨床針對性治療進程中，隨著患者體內結核分枝桿菌菌量會下降和病原抗原的消失，體內的抗原特異性T細胞會發生大量凋亡而進入收縮期，只保留少數的抗原特異性T細胞存在于體內，所以，在體外用抗原刺激不同治療階段的患者T細胞時，細胞因子的分泌量或分泌細胞因子的細胞數量與治療前相比都會下降，并與疾病的緩解相一致，因而具有較好的臨床預后價值。同時BCG表達的抗原與結核分枝桿菌毒性株中特有的抗原相比其安全性高。所以具有更好的亞單位或重組疫苗的研究價值和應用前景。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題之一是提供一種新的用于檢測結核分枝桿菌特異性免疫應答的試劑。本專利技術要解決的技術問題之二是提供上述試劑的用途。在本專利技術的一方面，提供一種檢測結核分枝桿菌特異性免疫應答的試劑，包括Rv0733 (Adenylate kinase, ADK)抗原或多肽或其類似物；所述Rv0733抗原的氨基酸序列從N端到C端如下:VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGKjn SEQ ID NO:1 所示；本專利技術中，所述多肽為一種氨基酸聚合物，其長度包含但不限于20個氨基酸殘基。所述其類似物為與其同源性在75%以上的多肽及經過天然或人工修飾后的氨基酸聚合物。所述多肽為編號ADK0-ADK16的氨基酸聚合物，其氨基酸順序從N端到C端列于下:ADKO:VRVLLLGPPG AGKGTQAVKLjn SEQ ID NO:2 所示；ADKl:AGKGTQAVKL AEKLGIPQIS，如 SEQ ID NO: 3 所示；ADK2:AEKLGIPQIS TGELFRRNIE，如 SEQ ID N0:4 所示；ADK3:TGELFRRNIE EGTKLGVEAKjn SEQ ID NO:5 所示；ADK4:EGTKLGVEAK RYLDAGDLVPjn SEQ ID NO:6 所示；ADK5:RYLDAGDLVP SDLTNELVDD，如 SEQ ID NO: 7 所示； ADK6:SDLTNELVDD RLNNPDAANGjn SEQ ID NO:8 所示；ADK7:RLNNPDAANG FILDGYPRSVjn SEQ ID NO:9 所示；ADK8:FILDGYPRSV EQAKALHEMLjn SEQ ID NO: 10 所示；ADK9:EQAKALHEML ERRGTDIDAVjn SEQ ID NO: 11 所示；ADKlO:ERRGTDIDAV LEFRVSEEVL，如 SEQ ID NO: 12 所示；ADKll:LEFRVSEEVL LERLKGRGRA，如 SEQ ID NO: 13 所示；ADK12:LERLKGRGRA DDTDDVILNRjn SEQ ID NO: 14 所示；ADK13:DDTDDVILNR MKVYRDETAPjn SEQ ID NO: 15 所示；ADK14:MKVYRDETAP LLEYYRDQLK，如 SEQ ID NO: 16 所示；ADK15:LLEYYRDQLK TVDAVGTMDE，如 SEQ ID NO: 17 所示；ADK16:TVDAVGTMDE VFARALRALG K，如 SEQ ID NO: 18 所示。本專利技術中所述多肽可通過化學合成得到，也可通過基因工程技術得到，此技術為行業內所熟悉。本專利技術所述抗原可以天然分離得到，也可以通過克隆技術和基因工程的方法獲得融合蛋白，此技術為行業內所熟悉。在本專利技術的另一方面，提供該試劑的用途，包括:本專利技術所述抗原或多肽可用于制備檢測結核菌感染的試劑，此試劑可包含部分或全部蛋白質氨基酸序列。本專利技術所述抗原或多肽可用于制備結核亞單位疫苗或用于重組結核疫苗開發。本專利技術所述試劑可用于區分臨床中不同類型的結核病，如單純肺結核與肺結核合并支氣管結核。本專利技術所述結核分枝桿菌感染人群包括有臨床癥狀的活動性結核病人和無癥狀的潛伏感染者。此處臨床癥狀包括但不限于發熱，咳嗽，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測結核分枝桿菌特異性免疫應答的試劑，包括Rv0733抗原或多肽或其類似物；所述Rv0733抗原的氨基酸序列從N端到C端如下：VRVLLLGPPGAGKGTQAVKLAEKLGIPQISTGELFRRNIEEGTKLGVEAKRYLDAGDLVPSDLTNELVDDRLNNPDAANGFILDGYPRSVEQAKALHEMLERRGTDIDAVLEFRVSEEVLLERLKGRGRADDTDDVILNRMKVYRDETAPLLEYYRDQLKTVDAVGTMDEVFARALRALGK，如SEQ?ID?NO:1所示；所述多肽為一種氨基酸聚合物，其長度至少為20個氨基酸殘基；所述其類似物為與其同源性在75％以上的多肽及經過天然或人工修飾后的氨基酸聚合物。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：肖洋炯，王穎，沈浩，王慧宇，田兆峰，賴允鑫，
申請(專利權)人：上海交通大學醫學院，
類型：發明
國別省市：
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