一種腸炎沙門氏菌的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)檢測方法。包括利用腸炎沙門氏菌PCR檢測引物檢測的步驟，其堿基序列為SEQ?ID?No.1~2。所述的方法，其步驟包括：1)提取食品中的DNA；2)以步驟1提取的DNA為模板進行PCR擴增；3)對PCR產物進行電泳檢測。本發明專利技術所設計的引物檢測特異性好,靈敏度高,非常適用于檢測食品中的腸炎沙門氏菌。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)檢測方法。包括利用腸炎沙門氏菌PCR檢測引物檢測的步驟，其堿基序列為SEQ?ID?No.1~2。所述的方法，其步驟包括：1)提取食品中的DNA；2)以步驟1提取的DNA為模板進行PCR擴增；3)對PCR產物進行電泳檢測。本專利技術所設計的引物檢測特異性好,靈敏度高,非常適用于檢測食品中的腸炎沙門氏菌。【專利說明】
本專利技術主要涉及食品質量檢測領域，屬于微生物檢測方法，具體涉及一種沙門氏菌PCR檢測方法。
技術介紹
沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)為腸桿菌科沙門氏菌屬,據其抗原結構和生化試驗，目前已有2000余種血清型，其中以鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌較為多見。該菌為革蘭氏陰性桿菌，需氧，不產生芽胞，無莢膜，絕大多數有鞭毛，能運動。對外界的抵抗力較強，在水和土壤中能活數月，糞便中能活I~2個月，在冰凍土壤中能越冬。不耐熱，55°C、lh或60°C、10~20分鐘死亡，5%石炭酸或1:500升汞5分鐘內即可將其殺滅。多種家畜(豬、牛、馬、羊)、家禽(雞、鴨、鵝)、魚類、飛鳥、鼠類及野生動物的腸腔及內臟中能查到此類細菌。細菌由糞便排出，污染飲水、食物、餐具以及新鮮蛋品、冰蛋、蛋粉等，人進食后造成感染。致病食物以肉、血、內臟及蛋類為主，值得注意的是該類細菌在食品中繁殖后，并不影響食物的色、香、味。沙門氏菌屬有的專對人類致病，有的只對動物致病，也有對人和動物都致病。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發生食物中毒。據統計在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。由沙門氏菌引起的食源性疾病的全球公共健康問題。在歐洲IS06579:2002和FSISMLG4.04中；檢測沙`門氏菌是評估產品是否合格的必檢項目。在美國，通常是肉，禽，蛋產品中檢測出沙門氏菌。由沙門氏菌引起了食源性疾病的全球公共健康問題。沙門氏菌是最常見的，新鮮家禽和豬的肉陽性標本的比例，根據歐洲標準(歐盟委員會法規2073/2005)用于評價產品是否符合標準，經分別檢測平均為5.5%和1.1 %。此外，美國食品安全檢驗局采用FSIS的方法，檢測沙門氏菌。這兩個標準的用于檢測沙門氏菌培養方法(SCMS)需要長達5天，才能獲得結果。這些方法包括預培養，在選擇性瓊脂上選擇性分離，可疑菌落的生化鑒定和血清學確認。該方法是雖然準確，但費力，成本高，費時，且對短保質期的產品無法檢測。目前，檢測沙門氏菌的方法檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。因此，需要有新的方法能夠在一個短的時間內檢測，最好能在24小時之內，在一個給定的食物量中檢測食品中的病原體。
技術實現思路
本研究的目的是:建立一個新的檢測食品中的病原體的方法。為達到直接在食品中腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)檢測的目的。本專利技術采用Primer Expressl.5軟件中設計的引物，提供一種沙門氏菌PCR檢測引物，其為:F:CACCAGGAGATTACAACATGACG SEQ ID N0.1R:CTAGCTCACACCAAAAGTGACCA SEQ ID N0.2。其中，所述的引物擴增片段為ISObp左右的片段，根據電泳結果，即可判斷為是否存在病原體基因。本專利技術還提供含有上述引物的沙門氏菌PCR檢測試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、純化水和Taq DNA聚合酶等。本專利技術還提供應用上述的試劑盒在食品中檢測沙門氏菌的方法，其包括:I)提取食品中的DNA ；2)以步驟I提取的DNA為模板進行PCR擴增；3)對PCR產物進行電泳檢測。其中，所述的PCR反應體系為:每20μ I的反應液中，含有(I)引物上、下游各15禮，10(^1;(2)10\?0?緩沖液，1.51111;(3)101111 dNTPs, 1.5ml ； (5) 5U/μ I Taq DNA 聚合BI, 100 μ I ；(4)純化水，3.0ml。(I)引物上、下游各 15mM,100y I ；(2) 10XPC`R 緩沖液(含 Mg2+ 20mM)，1.5ml ；(3) dNTPs (IOmM), 1.5ml ；⑷純化水，3.0ml ; (5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ I)，100 μ I。其中，所述的PCR反應條件為:951:預變性11^11，951:變性308，601:退火508，72°C延伸lmin，共35個循環，最后72°C延伸IOmin0取5~10 μ I PCR擴增產物點樣于2%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為90V，電泳時間為40min，然后觀察PCR擴增產物有無180bp左右的特異性片段。本專利技術中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據現有技術確定，并通過配置或商業途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本專利技術不再贅述。本專利技術公開了一種檢測食品中腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)的引物和試劑盒。本專利技術的檢測試劑盒能準確靈敏地檢測食品中的沙門氏菌，DNA最低檢測濃度為5ng，而且與其他細菌無交叉反應，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本低于傳統的檢測方法，而且本專利技術試劑保存時間長，無污染。本專利技術對解決大批量樣品的沙門氏菌的現場檢測技術具有重要的現實意義。【專利附圖】【附圖說明】圖1為引物特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。1:DNA Marker ；2:沙門氏菌；3:陰性對照；圖2為細菌菌數系列稀釋的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。1:DNA Marker ；2:陰性對照，5ng梯度稀釋的樣品、IOng梯度稀釋的樣品、20ng梯度稀釋的樣品、40ng梯度稀釋的樣品、80ng梯度稀釋的樣品。圖3為同時對腸炎沙門氏菌菌株和對照菌株(大腸桿菌、葡萄球菌)進行PCR檢測的電泳分析圖。1:DNA Marker ;2:腸炎沙門氏菌菌株擴增的結果，3.陰性對照(水)4.葡萄球菌菌株擴增的結果；5.大腸桿菌菌株擴增的結果；【具體實施方式】以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。本文所用到的腸炎沙門氏菌購自中科院微生物所菌種庫。實施例1在肉湯培養基中培養腸炎沙門氏菌，37°C培養24小時。4°C以14，OOOrpm離心10分鐘，并小心棄去上清液。將沉淀物重新懸浮于200 μ I的PBS中，在56°C下孵育20分鐘，然后在100°C下將懸浮液立即在冰上冷卻8分鐘，以14，OOOrpm離心5分鐘，在4°C下，取5 μ L上清液用作PCR的模板DNA。標準計數法檢測，菌體為IO81g CFU/mL。提取增菌肉湯的DNA,采用Qiagen公司的DNA提取試劑盒(QiagenBlood&CellCulture DNA Maxi Ki本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種腸炎沙門氏菌的檢測方法，其特征在于：包括利用腸炎沙門氏菌(Salmonella?Enteritidis)PCR檢測引物檢測的步驟，其堿基序列為SEQ?ID?No.1～2。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：謝克煥，
申請(專利權)人：大連德通生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：遼寧;21