一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌、遺傳改造方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌、遺傳改造方法及其應(yīng)用。通過(guò)對(duì)泰樂(lè)菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII)的同框敲除，獲得可以直接生產(chǎn)替米考星的合成前體—泰樂(lè)菌素B(Tb)的菌株。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌可直接發(fā)酵生產(chǎn)替米考星的合成前體，簡(jiǎn)化替米考星的合成工藝。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌、遺傳改造方法及其應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物
，具體地，本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌、遺傳改造方法及其應(yīng)用，本專(zhuān)利技術(shù)還涉及一種直接發(fā)酵生產(chǎn)替米考星合成前體泰樂(lè)菌素B的方法。
技術(shù)介紹
禽類(lèi)呼吸道感染誘發(fā)的疾病是當(dāng)今危害畜牧業(yè)發(fā)展的主要原因之一，目前用于防治此類(lèi)疾病的有效藥物很少，主要是采用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物泰樂(lè)菌素。泰樂(lè)菌素(Tylosin)，又名泰樂(lè)星、泰洛霉素，是一類(lèi)十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。美國(guó)禮來(lái)公司于1962年開(kāi)發(fā)并成功推向市場(chǎng)，迄今為止已工業(yè)化生產(chǎn)40多年，是一類(lèi)極其重要的禽畜專(zhuān)用抗生素，它廣泛用作飼料添加劑和動(dòng)物治療,能明顯促進(jìn)禽畜生長(zhǎng),并提高飼料的利用率。泰樂(lè)菌素的作用原理是，它通過(guò)與核糖體50S亞基結(jié)合從而選擇性地阻斷原核生物蛋白質(zhì)的合成，是一類(lèi)廣譜低毒的抗生素。由于存在耐藥性的問(wèn)題，以及近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在禽畜體內(nèi)有藥物殘留，再加之其與紅霉素等人用大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)具有很大的相似性，歐盟委員會(huì)1999年正式作出決議，禁止將泰樂(lè)菌素作為“動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑”用作飼料添加劑。20世紀(jì)80年代，英國(guó)Elanco動(dòng)物保健品公司開(kāi)發(fā)了以泰樂(lè)菌素為前體半合成的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)禽畜用抗生素-替米考星(Tilmicosin)，替米考星抗菌作用與泰樂(lè)菌素相似，主要抗革蘭氏陽(yáng)性菌和支原體，對(duì)少數(shù)革蘭氏陰性菌也有效，然而其對(duì)胸膜肺炎放線桿菌、畜禽支原體和巴氏桿菌的活性比泰樂(lè)菌素強(qiáng)。與泰樂(lè)菌素相比，替米考星具有與其類(lèi)似的分子結(jié)構(gòu)和更優(yōu)化、更廣的抗菌譜，并且與臨床常用的其它抗生素之間無(wú)交叉抗藥性，因此具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。替米考星已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)臨床使用于治療牛、山羊、綿羊、奶牛、豬、雞等動(dòng)物由敏感菌引起的傳染性疾病，特別是禽畜的呼吸道感染疾病。目前替米考星的傳統(tǒng)生產(chǎn)是將泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中的泰樂(lè)菌素包括泰樂(lè)菌素Ａ(Ta)和泰樂(lè)菌素Ｂ(Tb)。通過(guò)水解泰樂(lè)菌素A(Ta)，獲得泰樂(lè)菌素B(Tb)(見(jiàn)圖1)，然后泰樂(lè)菌素B通過(guò)胺化作用連接上一個(gè)3’5’-二甲基哌啶基，從而形成終產(chǎn)物替米考星。采用敲除碳霉糖糖基轉(zhuǎn)移酶tylCV的方法獲得了以泰樂(lè)菌素B產(chǎn)量上升的工程菌株，然而仍有一定量的泰樂(lè)菌素A產(chǎn)生，并且由于從發(fā)酵產(chǎn)物中提取泰樂(lè)菌素B的流程十分繁瑣，產(chǎn)物得率很低，因此在很大程度上限制了泰樂(lè)菌素B的應(yīng)用。因此本領(lǐng)域迫切需要對(duì)泰樂(lè)菌素生產(chǎn)菌進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的泰樂(lè)菌素B的工藝方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌及其應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)的另一目的是提供一種新型泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌的遺傳改造方法及其用途。在本專(zhuān)利技術(shù)的第一方面，提供了一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，所述的產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，泰樂(lè)菌素B(Tb)的相對(duì)含量滿足下式：B/(A+B)≥95%式中，B為發(fā)酵產(chǎn)物中泰樂(lè)菌素B(Tb)的質(zhì)量；A為發(fā)酵產(chǎn)物中泰樂(lè)菌素A(Ta)的質(zhì)量。在另一優(yōu)選例中，泰樂(lè)菌素B(Tb)的相對(duì)含量≥96%，更佳地≥99%，最佳地≥99.5%。在另一優(yōu)選例中，所述泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌為鏈霉菌屬。在另一優(yōu)選例中，所述泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌為弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)SWL00020，保藏編號(hào)為：CGMCCNo.6717。在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)生菌的基因組中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除。在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)生菌中缺失以下5種基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII。在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)生菌不表達(dá)以下5種基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII。在另一優(yōu)選例中，所述基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。在本專(zhuān)利技術(shù)的第二方面，提供了一種第一方面所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌的用途，它被用做發(fā)酵生產(chǎn)泰樂(lè)菌素B(Tb)的工程菌株。在本專(zhuān)利技術(shù)的第三方面，提供了一種生產(chǎn)泰樂(lè)菌素B(Tb)的方法，包括步驟：(a)培養(yǎng)第一方面所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，從而產(chǎn)生含有泰樂(lè)菌素B的發(fā)酵產(chǎn)物；和(b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出泰樂(lè)菌素B(Tb)。在本專(zhuān)利技術(shù)的第四方面，提供了一種生產(chǎn)替米考星的方法，(a)培養(yǎng)第一方面所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，從而產(chǎn)生含有泰樂(lè)菌素B的發(fā)酵產(chǎn)物；(b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出泰樂(lè)菌素B(Tb)；和(c)將分離出的泰樂(lè)菌素B(Tb)轉(zhuǎn)化為替米考星。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)所述轉(zhuǎn)化是將泰樂(lè)菌素B(Tb)與3’5’一二甲基哌啶基進(jìn)行胺化作用，形成替米考星。在本專(zhuān)利技術(shù)的第五方面，提供了一種制備泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌的方法，包括步驟：(1)構(gòu)建用于同源重組的載體，所述的載體依次含有以下元件：碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，連接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列；(2)將步驟(1)的所述載體導(dǎo)入出發(fā)菌株，獲得導(dǎo)入載體的菌株，其中所述的出發(fā)菌株可發(fā)酵產(chǎn)生泰樂(lè)菌素A和泰樂(lè)菌素B；(3)從步驟(2)獲得的導(dǎo)入載體的菌株中，篩選所述上游同源臂序列和下游同源臂序列與出發(fā)菌株的基因組發(fā)生了二次同源重組的菌株，從而獲得泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)之后還包括步驟(4)：驗(yàn)證泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌是否缺失碳酶糖合成基因簇。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)所述的連接序列為0-200bp長(zhǎng)度堿基序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)所述同源臂序列是用PCR擴(kuò)增的方法獲得的。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)所述同源臂序列的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，較佳地≥15000bp。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)所述載體為穿梭質(zhì)粒，較佳地為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)所述載體還含有抗生素抗性基因，較佳地為阿泊拉霉素抗性基因。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)所述的導(dǎo)入方法為接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入法。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)所述的出發(fā)菌株為鏈霉菌屬，較佳地為弗氏鏈霉菌，更佳地為弗氏鏈霉菌NRRL2702。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)所述的基因組與載體發(fā)生二次同源重組的菌株為失去阿泊拉抗性的二次同源重組的菌株。在另一優(yōu)選例中，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCI。在另一優(yōu)選例中，所述碳霉糖合成基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。在本專(zhuān)利技術(shù)的第六方面，提供了一種用于同源重組的載體，所述載體依次含有以下元件：碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，連接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列，且所述載體缺失碳霉糖合成基因簇。在另一優(yōu)選例中，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCI。在另一優(yōu)選例中，所述碳霉糖合成基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。在另一優(yōu)選例中，所述的連接序列為0-200bp長(zhǎng)度的堿基序列。在本專(zhuān)利技術(shù)的第七方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞含有第六方面所述的載體或染色體整合有碳霉糖合成基因簇上游和下游同源臂序列和3’同源臂序列，且缺失90%以上的碳霉糖合成基因簇。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或鏈霉菌，較佳地大腸桿菌為E.coliDH5α和E.coliET12567，鏈霉菌為弗氏鏈霉菌NRRL2702。應(yīng)理解，在本專(zhuān)利技術(shù)范圍內(nèi)中，本專(zhuān)利技術(shù)的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明下列附圖用于說(shuō)明本專(zhuān)利技術(shù)的具體本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，泰樂(lè)菌素B(Tb)的相對(duì)含量滿足下式：B/(A+B)≥95%式中，B為發(fā)酵產(chǎn)物中泰樂(lè)菌素B(Tb)的質(zhì)量；A為發(fā)酵產(chǎn)物中泰樂(lè)菌素A(Ta)的質(zhì)量。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，泰樂(lè)菌素B(Tb)的相對(duì)含量滿足下式：B/(A+B)≥95％式中，B為發(fā)酵產(chǎn)物中泰樂(lè)菌素B(Tb)的質(zhì)量；A為發(fā)酵產(chǎn)物中泰樂(lè)菌素A(Ta)的質(zhì)量；所述產(chǎn)生菌的基因組中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除；其中，所述泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌是弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)；和所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII。2.如權(quán)利要求1所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌為弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)SWL00020，保藏編號(hào)為：CGMCCNo.6717。3.如權(quán)利要求1所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述產(chǎn)生菌中缺失以下5種基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII。4.如權(quán)利要求1所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述產(chǎn)生菌不表達(dá)以下5種基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII。5.一種權(quán)利要求1所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌的用途，其特征在于，它被用做發(fā)酵生產(chǎn)泰樂(lè)菌素B(Tb)的工程菌株。6.一種生產(chǎn)泰樂(lè)菌素B(Tb)的方法，其特征在于，包括步驟：(a)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌，從而產(chǎn)生含有泰樂(lè)菌素B的發(fā)酵產(chǎn)物；和(b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出泰樂(lè)菌素B(Tb)。7.一種生產(chǎn)替米考...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉文，趙群飛，張華，董坤，彭欣，李慧芬，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31