一種人表皮生長因子的制備和純化方法技術

本發明專利技術公開了一種人表皮生長因子的制備和純化方法，包括構建重組質粒pBSAZ1.1myc-His6、構建重組質粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF、重組質粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF轉染CHO細胞和hEGF蛋白的分泌和純化的步驟。本發明專利技術采用現代生物技術，構建了微生物表達載體重組質粒pBSAZ1.1myc-His6-SUMO-hEGF，再將該表達載體轉至表達量高，易于純化以及容易適應大規模工業化發酵生產的CHO細胞，構建穩定的高分泌型工程菌，實現人表皮生長因子的生產。表達產物在分子結構、理化性質和生物學功能方面最接近天然的生物蛋白質分子，經過Balb/c3t3細胞的活性測定實驗顯示與標準品相比具有較高生物學活性，可達到1×105U/mg。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種人表皮生長因子的制備和純化方法，其特征在于，包括以下步驟：(a)?構建重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6：提取質粒pcDNA3.1(+)/myc?His?A，經限制性內切酶Bgl?II和Stu?I雙酶切處理，得到3392bp的片段；提取質粒pSecTag2?A，經限制性內切酶Bgl?II和Stu?I雙酶切處理，得到2186bp的片段；將3392bp片段與2186bp片段以體積比2:3的比例用連接酶連接；將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質粒并進行限制性內切酶Bgl?II和Stu?I雙酶切鑒定，得到重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6；(b)?構建重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6?SUMO?hEGF：提取重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6，經限制性內切酶BamH?I和Xho?I酶切，得到5525bp的片段，酶切產物純化后，加去磷酸化酶做去磷酸化處理；提取含hEGF基因片段的質粒pMD18?T?His6?SUMO?hEGF，經限制性內切酶BamH?I和Xho?I酶切得到486bp的hEGF基因片段；將5525bp片段與486bp片段以體積比1:4的比例用連接酶進行連接；將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆子，提取質粒并進行限制性內切酶BamH?I和Xho?I雙酶切鑒定，得到重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6?SUMO?hEGF；(c)?重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6?SUMO?hEGF轉染CHO細胞：在轉染試劑存在下將重組質粒pBSAZ?1.1?myc?His6?SUMO?hEGF轉染CHO細胞，篩選得到陽性轉化子，將轉化子連續傳代直至得到穩定細胞株；(d)?hEGF蛋白的分泌和純化：將轉染后穩定細胞株于培養基中培養，收集含有分泌的目的蛋白培養基，離心取上清液；親和層析，用清洗液除去雜蛋白后，加入洗脫液將hEGF洗脫，收集唯一的洗脫峰即為目的蛋白；將含有目的蛋白的樣品緩慢加入Ni?NTA柱，先用破菌緩沖液洗5個柱體積，再用PBS緩沖液洗3個柱體積；最后加入SUMO特異性切割酶Ulp1室溫反應10?30分鐘或4℃下2?6小時；用PBS洗脫酶切下來的hEGF，收集流出液。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王喆明，鄭學明，張宏波，馬經緯，
申請(專利權)人：杭州拜善晟生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33