核酸酶底物制造技術

本發明專利技術涉及用于催化性核酸酶的核酸底物以及這些底物的使用方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】核酸酶底物通過交叉引用的結合本申請要求于2011年9月9日提交的澳大利亞臨時專利申請號2011903686的優先權，將其全部內容通過交叉引用結合在此。
本專利技術總體上涉及核酸酶的領域。更確切地說，本專利技術涉及用于用于核酸酶的底物以及這些底物的使用方法。專利技術背景在過去的20年中已經發現了多種多樣的具有酶或催化活性的核酸分子。RNA酶（“核酶”）是天然存在的，但是可以被工程化為特異性地識別和修飾靶標RNA底物。體外進化技術有利于發現和開發更多的催化性核酸，包括脫氧核糖核酸，通常稱為“脫氧核酶”、“DNA酶”或“DNA核酶”。已經發現，體外進化的DNA核酶和/或核酶具有催化廣泛的反應的能力，包括核酸的裂解、核酸的連接、卟啉金屬化、以及碳-碳鍵、酯鍵或酰胺鍵的形成。具體地，DNA核酶和核酶已經表征為可在通過沃森-克里克堿基配對進行雜交之后特異性地裂解不同的核酸序列。DNA核酶能夠裂解RNA或DNA分子。核酶也能夠裂解RNA和DNA靶標序列兩者。“10-23”和“8-17”DNA核酶能夠裂解核酸底物的特異性RNA磷酸二酯鍵而生成具有2',3'-環磷酸和5'-羥基基團的反應產物。可以連接2',3'-環磷酸和5'-羥基產物的脫氧核酶（DNA核酶）的實例包括“7Z81”和“7Z48”連接酶。最近，已經描述了多組分核酸酶（MNA酶），該多組分核酸酶具有在MNA酶組裝易化子（例如有待被檢測的靶標分子）的存在下從兩個或更多個寡核苷酸組分（在此也被稱為“部分酶”）進行自組裝的能力。催化性核酸的多樣性特性有利于其在許多不同應用中的使用。催化性核酸的成功使用的關鍵要素是其修飾適當的底物的能力。總的來說，該底物與催化性核酸的雜交臂是基本上互補的，并且在催化作用部位包含一種特異序列或序列基序。在給定的催化性核酸與其底物之間的相互作用的性質決定了該酶是如何高效地接合和/或催化修飾其底物，并且因此是設計任何使用催化性核酸的系統的基本的考慮因素。催化性核酸在核酸、蛋白質以及小分子的檢測中具有體外診斷用途。這些用途通常涉及靶標或信號的放大，從而產生充足的信號，以用于對感興趣的分析物的穩健檢測。采用催化性核酸的方法需要被充分比率的催化活性修飾的底物，以允許在背景噪聲上的有效辨別。不同的方法可能需要使用不同的反應溫度，并且因此需要底物在所需溫度下被高效修飾（例如被裂解）。這些方法，如使用了MNA酶和DNA核酶的方法，允許在一個單一反應中對很多靶標同時進行多重分析（multiplexedanalysis），但是在多個靶標之間進行多重化和辨別取決于合適范圍的底物的存在，通常是每個靶標至少一個。本領域已知的可被高效修飾（例如被裂解）的底物的數量當前還不足以用于大規模多重化。先前在本領域中已知的DNA核酶和MNA酶底物是通過對多種可能的底物進行篩選以便通過經驗法確定被最有效地裂解的那些底物而得到的。這種篩選經常使用大量的靶向于對全長mRNA內的理論上可能的裂解位點進行裂解的DNA核酶。這種篩選經常是在生理條件（溫度、以及緩沖劑的離子強度、組成和pH值）下進行的。這種對在生理條件下被高效裂解的mRNA序列的發現的偏見是由于此類研究是關注于DNA核酶作為RNA體內表達抑制劑的治療用途。此類研究提供了一系列繁瑣的方案，用于對大量的假定的底物進行經驗法測量，以發現新的少數的被高效裂解的底物（參見例如凱恩斯（Cairns）等人，1999《自然生物技術》（NatBiotech）17:480-486）。這些研究導致了一組有限的用于對被高效裂解的底物進行選擇的設計指導方針，并且在許多情況下，這些指導方針關注于DNA核酶的設計而不是底物的設計，因為DNA核酶可被輕易調整，而mRNA不能被輕易調整。由這些研究而產生的一個共同指導方針是，R-Y核糖核苷酸基序在底物的裂解位點處的正合序列對于按下述順序的裂解效率非常重要：GU≥AU>GC>>>AC。在體外條件下的全長mRNA的裂解效率不是一種在細胞環境中的裂解效率的絕對量度，因為后者包含核糖核蛋白以及其他不易在體外進行模仿的致混淆因素。某些過去產生的設計指導方針可用于對一個長mRNA分子內的可被DNA酶和MNA酶在生理條件下高效裂解的的位點進行選擇，但是這些指導方針對于哪種底物可被足夠高效地裂解進行預測以用于體外診斷應用的能力有限。體外診斷應用需要的條件可以與在本領域中存在的通常被篩選并用于建立有限的底物設計指導方針的生理條件大為不同。需要一組用于底物序列的指導方針或序列基序，用于以更大的確定性來預測是否一種底物將在適用于體外診斷應用的條件下被MNA酶或DNA核酶高效地裂解。對于具有可利于改進催化性核酸功能的特性的催化性核酸底物還存在著一種需求。這些特性可包括，例如，促進在一系列條件下改進的催化性核酸功能的能力和/或擴大可在多路反應中同時檢測的靶標數量的能力。專利技術概述雖然很多人試圖建立可一致地生成高效底物序列的一種序列基序或一組設計指導方針，但迄今為止，還沒有鑒別出一種高效序列或一組指導方針認。本專利技術提供了有利于開發新的高效裂解底物的一系列原理。本專利技術因此提供了具有增強催化性核酸功能的特性的催化性核酸酶底物，由此解決了存在于本領域中的需求。在第一方面，本專利技術提供了一種用于催化性核酸酶的分離的多核苷酸底物，所述多核苷酸底物包括序列N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-rR-rY-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15，其中：rR是嘌呤核糖核苷酸；rY是嘧啶核糖核苷酸；N1-N15中的每一個是核苷酸；N5-N13中的六個或更多個是胞嘧啶核苷酸；并且N9-N15中少于三個是鳥嘌呤核苷酸。在第一方面的一個實施例中，多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：25-27、29-30、33、72-90或172-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。在第一方面的一個實施例中，N5-N13中的七個或更多個、或八個或更多個是胞嘧啶核苷酸。在第一方面的一個實施例中，N5-N13中的七個或更多個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29、73、76-80、82-83、85-90或172-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。在第一方面的一個實施例中，N5-N13中的八個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：76、77、80、83或87中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。在第一方面的一個實施例中，N4-N13中的七個或更多個或八個或更多個是胞嘧啶核苷酸。在第一方面的一個實施例中，N4-N13中的七個或更多個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：27、29、73、76-83、85-90或172-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。在第一方面的一個實施例中，N4-N13中的八個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：76、77、79-80、82-83、87、88或90中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。在第一方面的一個實施例中，N4-N12中的六個或更多個、七個或更多個或八個或更多個是胞嘧啶核苷酸。在第一方面的一個實施例中，N4-N12中的七個或本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于催化性核酸酶的分離的多核苷酸底物，所述多核苷酸底物包括序列N1?N2?N3?N4?N5?N6?N7?N8?rR?rY?N9?N10?N11?N12?N13?N14?N15，其中：rR是嘌呤核糖核苷酸；rY是嘧啶核糖核苷酸；N1?N15的每一個是核苷酸；N5?N13中的六個或更多個是胞嘧啶核苷酸；并且N9?N15中少于三個是鳥嘌呤核苷酸。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.09.09 AU 20119036861.一種用于催化性核酸酶的分離的多核苷酸底物，所述多核苷酸底物包括序列N1-N2-N3-N4-N5-N6-N7-N8-rR-rY-N9-N10-N11-N12-N13-N14-N15，其中：rR是嘌呤核糖核苷酸；rY是嘧啶核糖核苷酸；N1-N15的每一個是核苷酸；N5-N13中的六個或更多個是胞嘧啶核苷酸；N9是胞嘧啶核苷酸；嘧啶核糖核苷酸包括尿嘧啶；并且N9-N15中少于三個是鳥嘌呤核苷酸，其中所述多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29-30、72-90或172-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。2.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N5-N13中的七個或更多個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29、73、76-80、82-83、85-90或172-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。3.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N5-N13中的八個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：76、77、80、83或87中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。4.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N4-N13中的七個或更多個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29、73、76-83、85-90或172-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。5.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N8和N9是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：73、76、77、79、83或87中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。6.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N9-N15中的一個是鳥嘌呤核苷酸或者都不是鳥嘌呤核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29-30、72-75、77-79、81-90或174-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。7.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N1-N15中的十一個、十二個、或多于十二個是嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29、72-90或174-175中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。8.根據權利要求7所述的分離的多核苷酸底物，其中N1-N15中的十三個或十四個是嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29、73、76、81、86或174中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。9.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸底物，其中N1-N14中的十個或十一個是胞嘧啶核苷酸，并且該多核苷酸底物包括一個由SEQIDNO：29、74-76、81、86或87中的任一個所定義的序列，或由該序列組成。10....

【專利技術屬性】
技術研發人員：艾莉森·威爾彥·托德，伊麗莎·莫卡尼，伊夫林·梅瑞雅·利納迪，迪娜·羅納甘，
申請(專利權)人：斯比戴克斯私人有限公司，
類型：發明
國別省市：澳大利亞;AU