一種環狀芽孢桿菌及其在共生發酵技術制低聚半乳糖中的應用。環狀芽孢桿菌菌株（Bacilluscirculans）BLB-32已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.8864。采用本發明專利技術的環狀芽孢桿菌菌株產酶活力高達150u/ml以上，采用共生發酵技術轉化生產低聚半乳糖，可以實現一個罐反應達到大于57%純度的純度，替代傳統的酶反應和發酵反應兩步實施的技術，得到的低聚半乳糖反應液經過色譜分離即可得到大于90%的高純度的不同低聚半乳糖含量的系列產品。該技術可以節省掉菌體破碎機和離心機以及配套設施投資，節省占地空間，減少大量的能源消耗。同時制備的酶充分利用，減少了損失，酶利用率提升10%以上，提高了原料的利用率。
【技術實現步驟摘要】
環狀芽孢桿菌及其在共生發酵技術制低聚半乳糖中的應用
本專利技術涉及低聚半乳糖制備
，特別涉及一種環狀芽孢桿菌菌株，還涉及所述環狀芽孢桿菌菌株在共生發酵技術制備低聚半乳糖中的應用。
技術介紹
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,簡稱G0S),是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，是由半乳糖基和葡萄糖基構成的聚合度為2~8的低聚糖。本技術是以乳糖為原料，利用環狀芽孢桿菌產生的β -半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷鍵，生成半乳糖和葡萄糖，并通過轉半乳糖苷的作用，生成含有半乳低聚二糖到半乳低聚八糖的低聚半乳糖產品，并利用共生發酵技術和色譜分離技術生產高純度低聚半乳糖。 低聚半乳糖具有下列優良的生理學特性:①在大腸內能被對人體有保健作用的一類菌，包括雙歧桿菌，有選擇性地利用，每日攝取IOg低聚半乳糖后，體內雙歧桿菌即可成為優勢菌群它不被人體消化道酶水解，因而是一種低熱量糖；③能緩解乳糖不耐癥，促進礦物質吸收；④適用于糖尿病患者服用防齲齒；⑥抑制腸內腐敗菌和其它有害菌的生長，促進腸胃功能。低聚半乳糖產品廣泛應用于嬰幼兒食品、乳制品、飲料、焙烤食品、糖果等。目前，國內外工業化生產的方法主要是通過選出高活性菌種放大培養，然后破碎菌體、菌體和酶分離制備液體酶制劑，或將液體酶制劑依托載體物質通過干燥方式制成粉體，進行低聚半乳糖的生產，相關的制備工藝存在工藝路線較長，可利用的酶存在損失，酶的綜合利用率低，能耗高。原工業化生產低聚半乳糖50噸轉化罐，需要配備菌體破碎機和離心機以及配套設施，每小時耗電量240度以上，能源消耗大，而且生產量越大，能源消耗越大。
技術實現思路
為了解決以上低聚半乳糖生產中工藝路線較長，可利用的酶存在損失，酶的綜合利用率低，能耗高的問題，本專利技術提供了一種可以縮短生產工藝路線、減少設備投入、提高酶利用效率的環狀芽孢桿菌菌株。本專利技術還提供了所述環狀芽孢桿菌菌株共生發酵技術制備低聚半乳糖。一種環狀芽孢桿菌菌株，所述環狀芽孢桿菌BLB-32 (Bacillus circulansBLB-32)已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號 CGMCC N0.8864。本專利技術是通過以下措施實現的:一種環狀芽孢桿菌在共生發酵技術制低聚半乳糖中的應用，其特征是它包括如下步驟: (I)菌種擴大培養 將環狀芽孢桿菌BLB-32 (CGMCC N0.8864)斜面接種在搖瓶種子培養基中，30 — 37°C，100-250rpm的振蕩速度下培養10_24h，獲得擴大的菌種培養液；種子培養基:葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5_20g/L，硫酸鎂0.3 g/L, pH7.0，種子培養基進行121 °C和15分鐘的滅菌；(2)放大培養產酶 制酶培養基:乳糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸鎂0.3g/L，磷酸氫二鈉0.01 - 0.2g/L，磷酸二氫鈉0.01 - 0.2g/L，pH7.0，制酶培養基進行121°C和15分鐘的滅菌； 將步驟(1)得到的擴大的菌種培養液倒入盛有制酶培養基的發酵罐中接種培養，30 -37°C，攪拌速度100-300rpm，通入空氣培養30_72h，得到放大培養的環狀芽孢桿菌BLB-32培養液及其釋放的β_半乳糖苷酶用于生產低聚半乳糖； (3)共生發酵乳糖轉化制備低聚半乳糖 將放大培養的環狀芽孢桿菌BLB-32培養液及其釋放的半乳糖苷酶按接種量50-500ml/L移種于乳糖溶液中，乳糖溶液pH值4~7，反應溫度30~50°C，菌種邊生長邊產酶發酵；或者加入活性酵母共生發酵，活性酵母加入量l-10g/L ； 在厭氧條件下轉化60~120h，經過組分檢測低聚半乳糖達到57 %以上時放罐，然后進行活性炭脫色處理，脫色溫度60~90°C，脫色30~90分鐘，然后經過離子交換精制、濃縮，得到低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液。本方案的具體特點還有，乳糖溶液質量濃度為250g~500g/L。將低聚半乳糖濃縮液經過真空干燥，得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末產品。低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液通過色譜分離得到含量大于90%的低聚半乳糖液體，組分含量大于90%的低聚半乳糖液體經過真空干燥得到含量大于90%的低聚半乳糖粉體，實現低聚半乳糖不同組分含量的系列化產品制備。本專利技術的有益效果:采用本專利技術的環狀芽孢桿菌菌株及共生發酵轉化技術生產低聚半乳糖，該技術可以節省掉菌體破碎機和離心機以及配套設施投資，同時制備的酶充分利用，減少了損失，酶利用率提升10%以上，提高了原料的利用率。菌種產酶大于20u/ml為活力標準，低聚半乳糖產率測定采用AOAC法定方法2001.02食品中GOS的檢測方法測定低聚半乳糖含量，低聚半乳糖含量以57%為基準(國家新資源食品2008年第20號標準)O保藏信息:本專利技術所用菌株為環狀芽孢桿菌BLB-32，拉丁文學名Bacilluscirculans BLB-32，該菌株已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC N0.8864。本專利技術環狀芽孢桿菌菌株篩選方法 I)細胞菌懸液的制備 將菌體加入篩選培養基中培養，然后將培養好的菌懸液置于80°C水浴中加熱10~20分鐘，隨后將加熱處理過的菌懸液適當稀釋接種于芽孢桿菌分離培養基，置于37°C培養10~24小時，進一步作分離純化。準備6支裝有9mL無菌水的試管，編號I一6，用移液槍移取1000 μ L懸池液置于I號試管,再移取1000 μ L I號試管懸池液置于2號試管,依次做六個試管梯度稀釋。2)平板制作 將分離培養基熔化后冷至45°C左右倒平板，凝固后待用。 3)菌種篩選用移液槍分別取4、5、6號試管溶液各200 μ L (每個試管取2— 4份)置于合適的培養基平板，用涂抹棒均勻涂抹，30 - 37°C培養2 — 3天，培養至平板長出成熟菌落。4)菌種斜面培養挑取單菌落接種于斜面培養基，30 - 37°C培養2 - 3天，獲得生長成熟的斜面菌種。5)菌種擴大培養將生長成熟的斜面菌種接種在25ml/500mL搖瓶種子培養基中接種，30 — 37 °C，100-250r/min培養10-24小時，獲得擴大的菌種培養液。6)放大培養產酶將菌種擴大培養的菌種培養液接種在15升發酵罐接種培養，30 - 37°C，培養2-3天，進行產酶測定，已獲得高效產酶菌株，根據培養酶活力大小選出優良斜面出發菌株環狀芽孢桿菌(編號為BLB-32)于生產低聚半乳糖。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種環狀芽孢桿菌BLB?32(Bacillus?circulans?BLB?32）,已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?No.8864。
【技術特征摘要】
1.一種環狀芽孢桿菌 BLB-32 (Bacillus circulans BLB-32),已于 2014 年 2 月 27 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.8864。2.—種環狀芽孢桿菌在共生發酵技術制低聚半乳糖中的應用，其特征是它包括如下步驟:(I)菌種擴大培養 將環狀芽孢桿菌BLB-32 (CGMCC N0.8864)斜面接種在搖瓶種子培養基中，30 — 37°C，100-250rpm的振蕩速度下培養10_24h，獲得擴大的菌種培養液；種子培養基:葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5_20g/L，硫酸鎂0.3 g/L，pH7.0，種子培養基進行121 °C和15分鐘的滅菌； (2)放大培養產酶 制酶培養基:乳糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸鎂0.3g/L，磷酸氫二鈉0.01 - 0.2g/L，磷酸二氫鈉0.01 - 0.2g/L，pH7.0，制酶培養基進行121°C和15分鐘的滅菌； 將步驟(1)得到的擴大的菌種培養液倒入盛有制酶培養基的發酵罐中接種培養，30 -37°C，攪拌速度100-300rpm，通入空氣培養30_72h...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉宗利，王乃強，欒慶民，張莉，熊小蘭，周文福，杜倩，
申請(專利權)人：保齡寶生物股份有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37
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