從山藥分離出的新穎生物活性蛋白及其用途制造技術

本發明專利技術公開了分離自山藥薯蕷的蛋白，其在體外和在體內刺激雌激素和孕酮釋放，但是不會刺激乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖。所述蛋白在體內表現出抗骨質疏松活性。也公開了用于分離和純化所述蛋白的程序和所述蛋白的N端氨基酸序列，以及所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物用于在體內和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的治療用途，用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達水平的治療用途，和用于治療絕經期綜合征的治療用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】從山藥分離出的新穎生物活性蛋白及其用途對相關申請的交叉引用本申請要求2011年8月17日提交的美國臨時申請系列號61/524,477的權益，其特此通過引用整體并入。
本專利技術涉及源自山藥的生物活性蛋白及其用于增加血清雌激素和孕酮水平以及用于治療骨質疏松癥、絕經期綜合征和伴隨的認知減退的用途。
技術介紹
絕經是衰老過程的正常部分，絕經期間由卵巢分泌的雌激素和孕酮的水平逐漸下降。大約80%的婦女經歷輕微的或很少的癥狀。但是，有些婦女具有嚴重癥狀，包括：熱潮紅、嚴重出汗、焦慮、恐慌或抑郁、皮膚干燥和起皺、陰道干燥和不適、壓迫性尿失禁、膀胱炎、失眠、易怒（irritability）和骨質疏松癥。世界衛生組織在1990年公布的報告估計，全世界絕經后婦女的總人數為4.76億。在2030年前，預測的人數將達到12億。當前的減輕絕經期綜合征的治療是激素替代療法(HRT)，其由施用補充性的外源雌激素或雌激素加上孕酮組成，最經常通過使用丸劑、皮下植入物或皮膚貼劑進行。盡管HRT通過給絕經婦女提供外源雌激素來增加循環雌激素水平，但是由于絕經婦女之間的生理條件的個體差異，難以確定適當的劑量和治療持續時間。結果，HRT有時是無效的，且易于造成副作用，包括子宮內膜瘤、乳腺和卵巢癌、冠心病和中風。骨質疏松癥起因于增加的骨吸收速率和相對地降低的骨形成速率，導致減少的骨量和骨架的微結構衰退，以及增加的骨折風險。骨改建在絕經后歲月大幅增加，并在較老的骨質疏松癥患者中保持升高，這表示在絕經期中卵巢激素的喪失是骨質疏松癥的主要危險因素之一。這樣的骨狀態導致婦女中年齡相關的骨骼脆性增加。已經證實，小梁骨礦物質密度、小梁骨體積分數、小梁厚度和小梁數目都隨著年齡增長而下降。并且，較低的骨量主要特征在于較小的板/桿比（plate-to-rodratio）。所有這些變化減弱骨強度和增加骨質疏松性骨折的風險。承重鍛煉在絕經后婦女中具有成骨作用。但是，在老年人中需要劇烈鍛煉來產生成骨作用。已經證實，HRT與承重鍛煉的聯合應用具有協同效應。這表明，施用的雌激素可以增強成骨應答。選擇性雌激素受體調節劑(SERM)是一種補救手段，尤其是用于減輕絕經后骨質疏松癥。但是，沒有證據表明SERM會增加絕經婦女的內源雌激素水平，并因此可能不會減輕除了骨質疏松癥以外的絕經期綜合征。多項研究已經證實，從不同種的山藥塊莖分離出的蛋白或其它化合物具有抗氧化活性、殼多糖酶活性和免疫調節活性，包括活化雌激素受體。渴望開發針對絕經期綜合征癥狀的有成本效益的治療，以便減輕或預防由低血清雌激素水平和孕酮水平引起的骨質疏松癥和/或認知減退。
技術實現思路
本專利技術提供了源自山藥(薯蕷，Dioscoreaopposita)塊莖的新穎多肽。所述多肽增加循環雌激素水平、增量調節卵巢促卵泡激素受體(FSHR)的表達、升高卵巢芳香酶(卵巢CYP-19)，并表現出抗骨質疏松活性。在一個實施方案中，本專利技術提供了源自薯蕷根莖的分離的或基本上純的多肽，其中所述多肽具有約32.5kDA的分子量(通過在SUPERDEX7510/300GL柱上的色譜法確定)和N端序列Gly-Ile-Gly-Lys-Ile-Thr-Thr-Tyr-Trp-Gly-Gln-Tyr-Ser-Asp-Glu-Pro-Ser-Leu-Thr-Glu-Ala(SEQIDNO:1)。在一個實施方案中，當將所述肽施用給雌性主體時，血清雌激素和孕酮水平增加。本專利技術的另一個方面提供了所述多肽化合物和包含所述多肽化合物的提取物用于在體內和/或在體外增加雌二醇、雌激素和/或孕酮的水平的治療用途、用于增加芳香酶和/或促卵泡激素受體(FSHR)的表達水平的治療用途，和用于治療絕經期綜合征的治療用途。附圖說明通過不同實施方案的附圖和下面給出的詳細描述解釋本專利技術。所述附圖不應當用于將本專利技術限定至具體實施方案，而是用于解釋和理解。詳細描述和附圖僅僅是本專利技術的示例，而不是限制性的，本專利技術的范圍由所附權利要求書及其等同方案限定。附圖不是按比例繪制。通過結合附圖閱讀詳細描述會更容易地理解本專利技術的前述方面和其它伴隨的優點。圖1是山藥薯蕷的照片。圖2的色譜圖顯示了在HiPrep16/10DEAEFF柱上對薯蕷提取物的純化。圖3的色譜圖顯示了在HiPrep16/10PhenylFF(highsub)柱上對DO蛋白級分的進一步純化。圖4的色譜圖顯示了在Superdex7510/300GL柱上對DO蛋白級分的純化。圖5是DO提取物的15%非變性PAGE(左)和15%SDSPAGE(右)的照片，顯示了通過銀染色顯影的從DO提取物回收的蛋白。圖6A的色譜圖顯示了蛋白標準品葡聚糖藍和卵白蛋白在Superdex7510/300GL柱上的洗脫。圖6B的色譜圖顯示了蛋白標準品牛血清白蛋白和抑肽酶在Superdex7510/300GL柱上的洗脫。圖6C的色譜圖顯示了根據本專利技術的DO肽在Superdex7510/300GL柱上的洗脫。圖6D的圖表顯示了校正曲線，從該曲線確定DO肽的分子量。圖7顯示了分離的DO蛋白的N端序列。圖8的圖表顯示了根據本專利技術的DO蛋白對粒層細胞的雌激素活性；圖9的圖表顯示了NaOH處理過的DO肽對粒層細胞的雌激素活性。圖10的圖表顯示了HCl處理過的DO肽對粒層細胞的雌激素活性。圖11的圖表顯示了熱處理過的DO肽對粒層細胞的雌激素活性。圖12A是用DO肽治療2周以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌二醇)水平的圖表。圖12B是使用DO肽的4周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌二醇)水平的圖表。圖12C是使用DO肽的6周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清雌激素(雌二醇)水平的圖表。圖12D是根據本專利技術使用DO肽的2周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的圖表。圖12E是使用DO肽的4周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的圖表。圖12F是使用DO肽的6周治療期以后，Sprague-Dawley大鼠的血清孕酮水平的圖表。圖13的圖表顯示了粒層細胞中的卵巢CYP-19芳香酶的蛋白表達。圖14的圖表顯示了粒層細胞中的FSHR的蛋白表達。圖15的圖表顯示了用DO肽治療以后，得自大鼠的卵巢中的卵巢CYP-19芳香酶的mRNA表達。圖16的圖表顯示了用DO治療以后，得自大鼠的卵巢中的FSHR的mRNA表達。圖17的圖表顯示了用DO肽治療以后，得自大鼠的卵巢中的卵巢CYP-19芳香酶的蛋白表達水平。圖18的圖表顯示了用DO肽治療以后，得自大鼠的卵巢中的FSHR的蛋白表達水平。圖19的圖表顯示了DO對BT-483乳腺癌細胞增殖的影響。圖20的圖表顯示了DO對OVCA-429卵巢癌細胞增殖的影響。圖21的圖表顯示了用DO肽治療以后，大鼠的體重。圖22的圖表顯示了用DO肽治療6周以后，大鼠的椎骨L2的表觀小梁骨礦物質密度。圖23的圖表顯示了用DO肽治療6周以后，大鼠的椎骨L2的骨體積分數。圖24是根據本專利技術使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的小梁數目的圖表；圖25是使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的小梁厚度的圖表。圖26是使用DO肽的6周治療期以后，大鼠的椎骨L2的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在體外或在體內增加雌激素水平的肽，其中該肽選自：a)?分離的或基本上純的可得自薯蕷屬種(Dioscorea?sp.)的多肽，其中通過色譜法確定，該多肽具有約32.5?kDA的表觀分子量，其中在該多肽N端處的首21個連續氨基酸由SEQ?ID?NO:1組成；b)?所述多肽的片段，其中所述片段表現出增加雌激素的活性；和c)?與所述多肽具有至少85%序列同一性的變體，其中所述變體表現出增加雌激素的活性。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.08.17 US 61/5244771.在體外或在體內增加雌激素水平的肽，其中該肽選自：a)分離的可得自薯蕷屬種(Dioscoreasp.)的多肽，其中通過色譜法確定，該多肽具有約32.5kDA的表觀分子量，其中在該多肽N端處的首21個連續氨基酸由SEQIDNO:1組成；其中該肽的純化方法如下：將薯蕷的根莖剝皮，并以1:2(w/v)的比例在5%乙酸+0.1%β-巰基乙醇中在4℃均質化3小時；將勻漿物在17,700g在4℃離心30分鐘；收集上清液，并加入硫酸銨至80%飽和；將混合物在4℃攪拌過夜，并在17,700g在4℃離心1小時；收集上清液，并加入硫酸銨至80%飽和；將混合物在4℃攪拌過夜，并在17,700g在4℃離心1小時；保留沉淀物，即蛋白提取物，并再懸浮于凈化水中；將蛋白提取物混合物在重蒸餾H2O中透析過夜，然后在40,000g在4℃超速離心2小時；收集上清液，并進行快速蛋白液相色譜法；柱純化：將上述提取物的樣品調節至100mMTris(pH8.0)的終濃度，并應用于HiPrep16/10DEAEFF柱(GEHealthcare,Inc.,Princeton,NJ)，并通過FPLC進行色譜分離；洗脫緩沖液由緩沖液A和緩沖液B組成，所述緩沖液A為100mMTris(pH8.0)，緩沖液B為含有1MNaCl的100mMTris(pH8.0)；使用0-45%緩沖液B的梯度；洗脫曲線顯示為下圖中的色譜圖；收集級分D3，并在重蒸餾H2O中透析過夜；然后將級分D3調節至50%緩沖液B，并應用于HiPrep16/10PhenylFF(highsub)柱(GEHealthcare,Inc.,Princeton,NJ)，并通過FPLC進行色譜分離；使用由milli-QH2O和含有1M(NH4)2SO4的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)組成的洗脫緩沖液；用30-0%緩沖液B的梯度，洗脫柱；洗脫曲線顯示在下圖中；收集級分P1，并在重蒸餾H2O中透析過夜，然后凍干以得到粉末狀殘余物；將得自302的凍干粉末溶解在含有150mMNaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)中，應用于Superdex7510/300GL柱(GEHealthcare,Inc.,Princeton,NJ)，并通過FPLC進行色譜分離；以0.6ml/min的流速，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)洗脫柱；色譜圖400顯示在下圖中；收集級分S2，并在重蒸餾H2O中透析過夜并凍干至干燥；回收凍干的殘余物，并在-20℃儲存；。2.根據權利要求1所述的肽，其中該肽在體外或在體內增加孕酮的水平。3.根據權利要求1所述的肽，其是分離的可得自薯蕷屬種的多肽，其中通過色譜法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：施祖榮，黃金樂，童瑤，張艷波，張浩斌，
申請(專利權)人：香港大學，
類型：發明
國別省市：中國香港;81