本發明專利技術提供了一種人源PDL2HSA系列融合蛋白，包括人體PDL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白直接連接的融合蛋白，序列為SEQ?ID?N0.1的氨基酸序列和SEQ?ID?N0.2的核苷酸序列,以及人體PDL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白通過短肽連接的融合蛋白。本發明專利技術人通過PDL2HSA系列融合蛋白在D121肺癌腫瘤免疫模型的藥效研究試驗，以及PDLHSA系列融合蛋白在轉移型乳腺癌基因的轉殖模型(MMTV-PyVmT)腫瘤模型的藥效研究，結果顯示人源PDLHSA系列融合蛋白具有良好的抑制腫瘤生長和轉移的藥效。因此，本發明專利技術首次提供了PDLHSA系列融合蛋白可以用于制備檢測PD-1結合的試劑和T細胞體外體內活化的試劑/試劑盒，以及制備抗腫瘤的免疫藥物或疫苗制劑。為臨床治療腫瘤疾病和慢性感染提供新的有效的生物藥物，有較大的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術提供了一種人源PDL2HSA系列融合蛋白，包括人體PDL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白直接連接的融合蛋白，序列為SEQ?ID?N0.1的氨基酸序列和SEQ?ID?N0.2的核苷酸序列,以及人體PDL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白通過短肽連接的融合蛋白。本專利技術人通過PDL2HSA系列融合蛋白在D121肺癌腫瘤免疫模型的藥效研究試驗，以及PDLHSA系列融合蛋白在轉移型乳腺癌基因的轉殖模型(MMTV-PyVmT)腫瘤模型的藥效研究，結果顯示人源PDLHSA系列融合蛋白具有良好的抑制腫瘤生長和轉移的藥效。因此，本專利技術首次提供了PDLHSA系列融合蛋白可以用于制備檢測PD-1結合的試劑和T細胞體外體內活化的試劑/試劑盒，以及制備抗腫瘤的免疫藥物或疫苗制劑。為臨床治療腫瘤疾病和慢性感染提供新的有效的生物藥物，有較大的應用價值。【專利說明】—種人源PDL2HSA系列融合蛋白及其制備與應用
本專利技術涉及生物
，具體涉及一種人體免疫檢查點調節性融合蛋白，尤其涉及一種人源TOL2HSA系列融合蛋白及其制備與應用。
技術介紹
已有文獻報道，主要在T細胞上表達的編程性死亡I (PD-1)能夠與不同抗原遞呈細胞(APC)上編程性死亡配體II (PD-L2)蛋白相結合。抗原遞呈細胞APC表達的TO-L2能通過ro-Ι的連接抑制T細胞激活，從而幫助腫瘤逃脫免疫應答。(Shin等.J.Exp.Med.201:1531)。目前已公開了 ro-1和TO-L2的結構，以及這些分子在調控T細胞激活和耐受性情況中的信號傳導特征和功能(Kier等(2008)Ann.Rev.1mmunol.26:677)。本專利技術人通過科學研究和多種重組融合蛋白表達，發現不同類型或短肽連接的蛋白質通過與ro-L2部分結構域融合后，產生新型的蛋白對ro-1的結合能力各不相同。說明其融合蛋白通過形成新的蛋白構象，改變結合區域部位的分子間作用力后，會對融合蛋白ro-1的結合產生重要影響。依據融合蛋白新的構效關系和ro-1結合篩選實驗，以及動物模型進行T細胞增殖篩選，我們得到了目前最可能有治療效果的人源TOL2HSA系列融合蛋白。并進一步在腫瘤免疫模型和自發性腫瘤模型的動物試驗中得到驗證，這類蛋白的免疫激活作用優于TOL2與抗體結晶區融合蛋白(TOL2-FC)和抗H) — I抗體，且呈更少的自身免疫反應的副作用，為臨床治療腫瘤疾病的免疫治療或慢性感染等疾病，逆轉T細胞衰竭提供新的藥物。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于研究設計人源TOL2HSA系列融合蛋白及其制備方法和在制藥中的應用。本專利技術提供了一種人源H)L2HSA系列融合蛋白。所述人源TOL2HSA系列融合蛋白包括人體TOL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白直接連接的融合蛋白(H)L2-HSA)和人體TOL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白通過短肽連接的融合蛋白(roL2-n-HSA，η = O~12個氨基酸短肽的融合蛋白)。本專利技術提供了一種人源TOL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白直接連接的TOL2-HSA融合蛋白所對應的氨基酸序列SEQ ID N0.1和核苷酸序列SEQ ID N0.2。本專利技術還提供了人源roL2-n-HSA融合蛋白所對應的連接短肽的序列和核苷酸序列，以及在SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2的插入位置。本專利技術的另一目的是提供了所述一種人源TOL2HSA系列融合蛋白的制備方法，該方法包括下列步驟:(I)制備分離的人源TOL2HSA系列融合蛋白的核酸分子:用聚合酶鏈式反 應(PCR)技術獲得分離的編碼H)L2HSA系列融合蛋白質的核酸；或直接合成TOL2HSA系列融合蛋白質的核酸分子；或通過酶切連接不同片段的核酸分子到表達載體而獲得TOL2HSA系列融合蛋白質的核酸分子。(2)制備人源TOL2HSA系列融合蛋白質通過宿主細胞中的重組獲得:用含有編碼多肽的核苷酸序列的核酸轉化、轉導、或轉染細菌或真核宿主細胞，利用多種基于病毒的表達系統來表達TOL2HSA融合蛋白質，制備人源TOL2HSA融合蛋白質(3)純化人源TOL2HSA系列融合蛋白質。本專利技術方法所述步驟(2)的真核宿主細胞為昆蟲、酵母、或哺乳動物細胞。對于表達和制備多肽有用的真核系統是本領域公知的，包括例如哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞。對于真核宿主細胞，可利用多種基于病毒的表達系統來表達H)L2-HSA融合蛋白質。基于病毒的表達系統是本領域公知的，而且包括但不限于桿狀病毒、猿猴病毒40(SV40)、逆轉錄病毒或基于痘苗的病毒載體。使用具有適宜調控元件和選擇標志的表達載體來制備穩定表達變體共刺激多肽的哺乳動物細胞系，例如，PDL2HSA系列融合蛋白質可以用Lonza公司的谷氨酰胺合成酶加壓篩選(GS)真核表達系統，Invitrogen公司的二氫葉酸還原酶(DHFR)篩選真核表達系統，Invitrogen公司的畢赤酵母(Pichia)酵母表達系統來進行表達和制備。本專利技術方法所述步驟(3)的純化人源TOL2HSA系列融合蛋白質可以使用例如層析方法來分離I3D-1拮抗劑多肽，諸如DEAE離子交換、凝膠過濾和羥基磷灰石層析。例如，可以使用蛋白G柱來分離細胞培養物上清液或細胞質提取物中的共刺激多肽。在一些實施方案中，可以“工程化改造”變體共刺激多肽以含有容許多肽被捕捉到親和基質上的氨基酸序列。例如，可以使用標簽來幫助多肽純化，諸如原癌基因蛋白c-myc、血凝素、多組氨酸或FlagTM(Kodak)。此類標簽可以插入多肽內的任何處，包括羧基或氨基端任一。其它可能有用的融合包括幫助檢測多肽的酶，諸如堿性磷酸酶。也可以使用免疫親和層析來純化共刺激多肽。本專利技術的又一目的是提供了所述一種人源TOL2HSA系列融合蛋白用于制備檢測PD-1結合的有關試劑和T細胞體外體內活化的有關試劑/試劑盒。本申請實施例2中，PDL2HSA融合蛋白能夠直接結合ro-Ι，因此可以直接用于制備檢測I3D-1結合的有關試劑/試劑盒。實施例3中，PDL2HSA融合蛋白能夠刺激T細胞增多，因此TOL2HSA融合蛋白可以直接應用于T細胞體活化的的激活試劑/或與激活有關的試劑盒中，PDL2HSA系列融合蛋白也可以應用于體外培養，激活或增殖T細胞。TOL2與抗體結晶區融合蛋白(H)L2-FC)因為含有抗體結晶區(FC)部分，具有FC受體細胞一般有B細胞、殺傷細胞、巨噬細胞，這些細胞能夠通過FC受體結合TOL2-FC融合蛋白，因此仍可能傳遞免疫抑制信號。并且因為TOL2-FC融合蛋白結合FC受體后會發生細胞的內吞作用，能夠降低細胞外TOL2-FC融合蛋白的濃度，從而減少與I3D-1結合并刺激T細胞增殖的作用。本專利技術人發現由于人源H)L2HSA系列蛋白能夠在腫瘤免疫模型和自發性腫瘤模型的動物試驗中具有療效，表明只有人源TOL2HSA系列蛋白能夠才能滿足臨床藥物開發過程中需要有動物實驗的藥效要求。本專利技術還有一 個目的是提供了所述一種人源TOL2HSA系列融合蛋白在制備治療腫瘤疾病藥物中的應用。在腫瘤病人中，腫瘤細胞，或帶有腫瘤抗原的抗原遞呈細胞(APC)通過結合T細胞，而部分或完全抑制宿主的針對腫瘤的免疫殺傷力。而TOL2HSA系列融合蛋本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人源PDL2HSA系列融合蛋白，其特征在于，所述人源PDL2HSA系列融合蛋白包括人體PDL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白直接連接的融合蛋白PDL2?HSA和人體PDL2蛋白的部分結構域與人體白蛋白通過短肽連接的融合蛋白PDL2?n?HAS；所述n＝0～12個氨基酸短肽的融合蛋白。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉辰，劉源，
申請(專利權)人：亞飛上海生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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