本發明專利技術公開了一種抗CD20單鏈抗體的植物種子表達系統，它是按VL-VH-Linker-hIgG1Fc順序，在基因的5’端有編碼大麥α-Amylase信號肽序列的核苷酸序列，設計并人工合成了抗CD20單鏈抗體基因，將基因插入植物種子特異表達載體p1301b中，通過農桿菌介導法轉化植株；將帶有種子特異性啟動子，抗CD20單鏈抗體基因和終止子的表達框整合進植物基因組中；篩選和培養出了帶有上述基因的植株，進一步通過篩選和擴繁得到了純合植株，該純合植株所產生的種子中含有所述的抗CD20單鏈抗體；重組蛋白定向表達在液泡內；表達的抗CD20單鏈抗體具有生物學活性，對Daudi細胞的ADCC殺傷能力與Rituxan無顯著差異。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬基因工程
，具體涉及抗CD20單鏈抗體基因及利用植物種子特異性表達啟動子在植物種子中高效表達抗CD20單鏈抗體的方法。
技術介紹
????根據《2012中國腫瘤登記年報》顯示，目前我國每年新發癌癥病例約312萬，因癌癥死亡超過200萬。惡性腫瘤已經成為我們城鄉居民的第一位死亡原因。非霍奇金氏淋巴瘤（Non?Hodgkin’s?lymphoma,?NHL）是最常見的淋巴系統惡性腫瘤，其中絕大多數為B細胞淋巴瘤。CD20抗原是一種B細胞分化抗原，位于B細胞的表面，僅存在于成熟B細胞和B細胞前體中，在正常組織中不表達，而在95%以上的B細胞淋巴瘤中均有過量表達。這也使CD20成為了治療B細胞淋巴瘤的一個理想靶點。Rituxan（Rituximab，美羅華）為美國羅氏公司產品，是一種人鼠嵌合抗體。Rituxan于1997年獲得FDA批準上市，是第一個被批準用于治療惡性腫瘤的單克隆抗體。目前用于治療低惡度、濾泡型B細胞淋巴瘤。 隨著對Rituxan治療其他一些自身免疫性疾病研究的深入，Rituxan在臨床疾病治療方面的潛在價值將會被進一步開發，社會對其的需求也越來越大。但是由哺乳動物細胞（CHO）生產的Rituxan需要昂貴的設備和培養基，從而增加了其生產成本，導致其價格高昂（一療程的費用約20萬元人民幣左右）。 利用植物反應器已經成功的表達了多種具有生物活性和功能的藥用蛋白，其中包括單克隆抗體、疫苗抗原、治療用酶、血液蛋白、細胞因子、生長因子和生長激素等。而以植物作為生物反應器則具有諸多的特點和優點：（1）可根據重組蛋白的需求來選擇不同形式的表達體系，可分為整株表達和組織特異性表達，如種子、須根，以及懸浮細胞等；（2）大規模生產時具有較低的生產成本和靈活性；（3）植物具有與哺乳動物細胞相似的蛋白翻譯后修飾途徑，從而獲得有功能的活性蛋白；（4）較高的安全性，不攜帶動物病原體；（5）便于儲藏和運輸。 盡管豆類和谷類等種子植物相對于葉類作物產生較少的生物量，但卻為儲存提供了極佳的條件。葉類作物在采樣后，葉片需要冰凍或干燥以備運輸，或立即進行處理；而成熟的種子卻可以在室溫下長時間存儲。在長期的進化過程中，種子作為植物的貯藏器官，可以在很小的空間內積累大量的蛋白質，且種子中含有豐富的分子伴侶、適宜蛋白質折疊的環境以及較少的蛋白激酶。此外，大多數的種子體積較小，這樣可以使表達的重組蛋白高度集中，雖然總生物產量并沒有葉片植物高，但卻有利于蛋白質的下游提取和純化；而且植物種子表達重組蛋白，不會影響植物的生長。而通過將重組蛋白定向表達至液泡中存儲，不僅可以獲得完整的翻譯后修飾，還可以提高重組蛋白的表達量。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種融合基因，抗CD20單鏈抗體基因，以及利用植物種子表達系統表達抗CD20單鏈抗體基因，生產抗CD20單鏈抗體。 抗CD20單鏈抗體基因，它包括：輕鏈可變區-重鏈可變區-連接肽-人免疫球蛋白G的Fc片段并且在其5’端加入了編碼大麥α-Amylase的信號肽序列； 所述的抗CD20單鏈抗體基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示； 一種植物表達載體質粒，它是在植物表達載體中插入了上述的抗CD20單鏈抗體基因； 所述的植物表達載體為植物種子特異表達載體p1301b； 所述的植物種子特異表達載體p1301b，是由下述方法構建的：人工合成了β-phaseolin的啟動子和終止子序列，并在啟動子兩端分別添加Xho?I和Nco?I酶切位點，在終止子兩端分別添加Hind?III和Kpn?I酶切位點；并通過KpnI和Bst?EII雙酶切的方法從pBASTA質粒上獲得35S+Bar基因；同時利用Kpn?I和Bst?EII雙酶切pCambia1301，連入35S+Bar原件，構建中間載體p1301Bas。再通過酶切，連接反應將β-phaseolin的啟動子和終止子原件連接至p1301Bas中； 抗CD20單鏈抗體，它是由下述方法生產的： 1、將上述的一種植物表達載體質粒，轉化至根瘤農桿菌EHA105中； 2、再將根瘤農桿菌轉染至植物中； 3、培育所述的植物，采集種子；提取抗CD20單鏈抗體蛋白； 所述的植物為擬南芥、紅花、玉米或亞麻芥。 上述的抗CD20單鏈抗體在制備治療非霍奇金氏淋巴瘤及自身免疫性疾病藥物中的應用。 本專利技術提供了一種抗CD20單鏈抗體的植物種子表達系統，它是按VL-VH-Linker-hIgG1Fc順序，在基因的5’端有編碼大麥α-Amylase信號肽序列的核苷酸序列，設計并人工合成了抗CD20單鏈抗體基因，將基因插入植物種子特異表達載體p1301b中，通過農桿菌介導法轉化植株；將帶有種子特異性啟動子，抗CD20單鏈抗體基因和終止子的表達框整合進植物基因組中；篩選和培養出了帶有上述基因的植株，進一步通過篩選和擴繁得到了純合植株，該純合植株所產生的種子中含有所述的抗CD20單鏈抗體；重組蛋白定向表達在液泡內；且表達的抗CD20單鏈抗體具有生物學活性，對Daudi細胞的ADCC殺傷能力與Rituxan無顯著差異。 采用本專利技術的方法生產抗CD20單鏈抗體具有如下優點： 1、通過采用分泌型表達，重組蛋白可以獲得正確的折疊，組裝和修飾，并且定向儲藏在液泡內，確保了重組藥用蛋白的生物學活性的獲得； 2、利用植物表達外源蛋白可以避免大腸桿菌內毒素和動物病原體的污染； 3、通過利用種子特異性強啟動子，可有效提高重組蛋白的表達量； 4、利用植物種子表達系統生產抗CD20單鏈抗體，可以有效降低生產成本，同時有利于抗CD20單鏈抗體的產業化。 附圖說明 圖1是人工合成的植物密碼子偏好性的抗人CD20單鏈抗體基因的酶切鑒定圖；其中：1、DL2000，?2--4、質粒，5、對照質粒，6、DL15000； 圖2是植物種子表達載體p1301-Ri的構建過程示意圖； 圖3是表達載體p1301-Ri的雙酶切鑒定圖；其中：1、DL2000，?2、質粒； 圖4是表達載體p1301-Ri的結構詳細示意圖； 圖5是轉基因擬南芥種子的SDS-PAGE電泳圖；其中：1、非轉基因擬南芥，2--4、轉基因擬南芥； 圖6是抗人CD20單鏈抗體在擬南芥種子中表達的Western?Blot檢測圖；其中：1--6、轉基因擬南芥，7、非轉基因擬南芥； 圖7是抗人CD20單鏈抗體的生物學活性檢測圖。 具體實施方式 實施例1中間載體p1301b的獲得 根據TC.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
抗CD20單鏈抗體基因，它包括：輕鏈可變區?重鏈可變區?連接肽?人免疫球蛋白G的Fc片段，并且在其5’端加入了編碼大麥α?Amylase的信號肽序列。
【技術特征摘要】
1.抗CD20單鏈抗體基因，它包括：輕鏈可變區-重鏈可變區-連接肽-人免疫球蛋白G的Fc片段，并且在其5’端加入了編碼大麥α-Amylase的信號肽序列。
2.根據權利要求1所述的抗CD20單鏈抗體基因，其特征在于：它的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.一種植物表達載體質粒，它是在植物表達載體中插入了權利要求1所述的抗CD20單鏈抗體基因。
4.根據權利要求3所述的一種植物表達載體質粒，其特征在于：所述的植物表達載體為植物種子特異表達載體p1301b。
5.根據權利要求4所述的一種植物表達載體質粒，其特征在于：所述的植物種子特異表達載體p1301b，是由下述方法構建的：人工合成了β-phaseolin的啟動子和終止子序列，并在啟動子兩端分別添加Xho?I和Nco?I酶切位點，在終止子兩端分別添加Hind?III和Kpn?I...
【專利技術屬性】
技術研發人員：姜潮，李校堃，王德仲，李海燕，劉秀明，姚娜，金立波，
申請(專利權)人：吉林農業大學，
類型：發明
國別省市：吉林;22
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