一種單核苷酸多態性熔解曲線分析方法技術

本發明專利技術涉及一種單核苷酸多態性熔解曲線分析方法。本發明專利技術的方法基于等位基因特異性擴增法，針對已知SNP檢測位點，設計兩條特異性引物，其中一條特異性引物設計時加入一段無關序列，從而增加兩種不同PCR產物的Tm值的區分度，在一個體系中檢測已知SNP突變，明確區分野生型，雜合型和突變型，為臨床檢測提供一種結果穩定，重復性好，適用機型更廣的SNP分析方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及體外診斷核酸分析檢測
；更具體地，本專利技術涉及。
技術介紹
單核苷酸多態性(Singlenucleotide polymorphism, SNP),是指基因組 DNA 中某一特定核苷酸位置上發生轉換、顛換、插入或缺失等變化。SNP在人類基因組中廣泛存在，大概每1000個堿基就有一個SNP。SNP是人類遺傳學變異中最常見的一種，絕大多數疾病的發生與環境因素和遺傳因素的綜合作用有關，通常認為是在個體具有遺傳易感性的基礎上，環境有害因素作用而導致疾病。不同群體和個體對疾病的易感性、抵抗性以及其他生物學性狀(如對藥物的反應性等)有差別，其遺傳學基礎是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是SNP，占所有已知多態性的90%以上。隨著人類基因組計劃的進展，人們愈來愈相信基因組中的SNP有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環境因子的反應，尋找和研究SNP已成為人類基因組計劃的內容和目標之一。繼限制性片段長度多態性和微衛星多態性這兩個遺傳標記之后，成為第三代分子標記。SNP具有數量多，分布廣及高度穩定性，適于快速、規模化篩查，易于基因分型等特點，很適合對復雜性狀與疾病的遺傳解剖以及基于群體的基因識別等方面的研究。SNP檢測在分子診斷、臨床檢驗、法醫學、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發等方面凸顯出越來越重要的價值。I) SNP檢測技術 發展很快，出現了許多SNP檢測技術。大致可以分為以下幾種:(1)測序方法:Sanger雙脫氧測序，焦磷酸測序(Pyrosequencing),SNaPshot微測序；(2)基于雜交的方法=Taqman探針法，DNA芯片法；(3)熔解曲線:高分辨率熔解曲線分析技術(High Resolution Melt, HRM) ； (4)引物延伸:基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix Assisted Laser Desorption 1nization Time of Flight, MALD1-T0F)；[5]變性高效液相色譜技術(DenaturingHighPerformance Liquid Chromatography,DHPLC) ；(6)以構象為基礎的方法:限制性片段長度多態性分析法(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)，單鏈構象多態性分析法(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP),變性梯度凝膠電泳法(Denaturing Gradient GelElectrophoresis, DGGE)。各種不同的檢測方法，各有優缺點，以構象為基礎的方法目前已很少使用，Sanger測序是SNP檢測的金標準，能發現已知SNP，也能發現未知SNP ;缺點是每個樣本的每個位點均需要經PCR擴增，跑膠，然后切膠純化，再測序，步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，價格昂貴，不適合大樣本多位點檢測。微測序方法(SNaPshot)類似普通測序，10個位點PCR產物同時引物延伸，通量增加；劣勢在于每個樣品的每個位點都需要PCR預先擴增，跑膠，割膠，DNA純化。10個位點可以同時測序，提高了測序效率，但對延伸引物要求極高，如每個引物有4-6個堿基差異，不能有互補區段，還要相同條件延伸，除廠家已經驗證的少數位點外，很難自己設計針對新位點的檢測。多個分散步驟，費錢費時，易出錯。基于雜交的方法包括實時熒光Taqman探針檢測和DNA芯片法，只能檢測已知SNP位點，不能同時發現未知SNP，Taqman探針法的通量低，DNA芯片法的準確性低，需重復驗證。MALD1-TOF和DHPLC優點是快捷、所需樣標本量極少，MALD1-TOF適宜于已經優化的特定SNP檢測，不適宜該服務從未做過的新SNP檢測。DHPLC可判斷有否突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標準樣品或結合測序驗證。不同核酸分子的片段長短、GC含量、GC分布等是不同的,任何雙鏈DNA分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。高分辨率熔解曲線分析(high resolutionmelting analysis, HRM)就是在PCR反應體系中加入飽和染料，在PCR反應完成后進行升溫變性，并在升溫過程中采集熒光信號，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就下降了，儀器實時記錄溫度和熒光強度的變化，形成熔解曲線，根據熔解曲線的不同來對樣品來進行區分。高分辨率熔解曲線-HRM技術具有如下優點:高通量、簡單、快速、低成本、高靈敏度；閉管檢測，避免污染造成的假陽性；可檢測已知和未知SNP ;與傳統的擴增后需借助額外的儀器進行凝膠電泳的非均一性的突變檢測(例如dHPLC)相比，HRM提供了更高特異性和靈敏度的檢測，同時允許更高的樣本檢測通量，大大降低了成本。其缺點在于只能在如LightCycIer?480PCR儀,或LightScanner等少量儀器上使用。專業技術要求高，需要專業人員操作。高分辨率熔解曲線對應分析為圖像學分析，所有分析都基于野生型、突變型、雜合型參比品熔解曲線的結果，目前實驗過程中，突變型多為質粒，質粒和標本擴增效率存在差異的，最后熔解曲線峰和實際的標本擴增結果有差異，會導致實驗結果誤判。另外HRM對標本定量要求非常嚴格，如果標本定量不準，不同標本之間擴增效率會有差異，會影響后面的分析結果，兩種純合 狀態可能會誤判，在標本定量較準的情況下，也有可能因為不同標本中存在的抑制PCR擴增的因素不一樣，導致擴增效率有所不同，同樣也會干擾最后的分析結果。在大量標本檢測過程中，一部分標本檢測會被判讀為未知突變，需要其它檢測方法驗證。針對高分辨率熔解曲線法的一些弊端，需要一種適用機型更廣，結果穩定，重復性好，適用于臨床應用的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供。本專利技術提供一種基于等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，包括如下步驟:(I)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的公用引物為引物，以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增；其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括針對野生型等位基因位點的引物I ;針對突變型等位基因位點的引物2，所述引物I和引物2具有如下序列:A-B-C ;其中，A為與模板匹配的序列片段，B為針對SNP位點的堿基；B在引物I和引物2中不同，在一條引物中B與野生型SNP位點堿基匹配，在另一引物中B與突變型SNP位點堿基匹配；C為無或為1-2個堿基的與模板匹配的序列片段；且，引物I或引物2中一條引物的5’端還包括5-30個(較佳地6_20個；更佳地8-20個；如10個)堿基的與野生型及突變型模板均不匹配的無關序列，使得引物I與引物2的Tm值差異大于2V (如2-8°C ;較佳地3-7°C ;更佳地4-6°C ;如5°C )；所述的公用引物是遠離SNP位點的引物，其與引物I或引物2構成引物對；(2)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型(包括:野生型基因、突變型基因或雜合型基因)。在一個優選例中，所述的引物I與公用引物的擴增產物的長度小于IOObp ;和/或所述的引物2與公用引本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的公用引物為引物對，以Taq?DNA聚合酶進行PCR擴增；其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括針對野生型等位基因位點的引物1；針對突變型等位基因位點的引物2，所述引物1和引物2具有如下序列：A?B?C；其中，A為與模板匹配的序列片段，B為針對SNP位點的堿基；B在引物1和引物2中不同，在一條引物中B與野生型SNP位點堿基匹配，在另一引物中B與突變型SNP位點堿基匹配；C為無或為1?2個堿基的與模板匹配的序列片段；且，引物1或引物2中一條引物的5’端還包括5?20個堿基的與野生型及突變型模板均不匹配的無關序列，使得引物1與引物2對應的特異性PCR產物Tm值差異大于2℃；所述的公用引物是遠離SNP位點的引物，其與引物1或引物2構成引物對；(2)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型。

【技術特征摘要】
1.一種基于等位基因特異性擴增的SNP檢測方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)以待測基因為模板，以針對SNP位點的特異性引物以及與特異性引物配對的公用引物為引物對，以Taq DNA聚合酶進行PCR擴增； 其中，所述的針對SNP位點的特異性引物包括針對野生型等位基因位點的引物I ;針對突變型等位基因位點的引物2，所述引物I和引物2具有如下序列: A-B-C ;其中，A為與模板匹配的序列片段，B為針對SNP位點的堿基；B在引物I和引物2中不同，在一條引物中B與野生型SNP位點堿基匹配，在另一引物中B與突變型SNP位點堿基匹配；C為無或為1-2個堿基的與模板匹配的序列片段； 且，引物I或引物2中一條引物的5’端還包括5-20個堿基的與野生型及突變型模板均不匹配的無關序列，使得引物I與引物2對應的特異性PCR產物Tm值差異大于2V ； 所述的公用引物是遠離SNP位點的引物，其與引物I或引物2構成引物對； (2)分析PCR擴增產物，確定待測樣品中待測基因的SNP類型。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物I與公用引物的擴增產物的長度小于IOObp ;和/或所述的引物2與公用引物的擴...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭安亮，姚見兒，劉榴，
申請(專利權)人：上海透景生命科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31