一種板層角膜基質支架及其制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種板層角膜基質支架及其制備方法，該方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理，并在酶消化處理后進行超聲處理，然后再進行干燥和滅菌處理。本發明專利技術還提供了所述板層角膜基質支架在作為角膜基質替代物中的應用。本發明專利技術的方法最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，板層結構保留完整，提高了支架材料的生物相容性。

【技術實現步驟摘要】
一種板層角膜基質支架及其制備方法和應用
本專利技術涉及角膜基質替代物領域，具體地，涉及一種板層角膜基質支架及其制備方法和應用。
技術介紹
角膜位于眼球最表面，直接與外界接觸，容易受到損傷(物理、化學)和感染，一旦發生病變則會發生混濁而影響視力，甚至致盲。常見的角膜病變有角膜炎、角膜潰瘍、圓錐角膜、角膜軟化癥和角膜變性等。據世界衛生組織(WHO)統計，目前全世界有角膜病盲患者近5000萬人，我國有約400萬人。角膜病嚴重影響了患者們的正常生活、工作與學習，生活上需要家人和社會的照顧，增加了家庭的經濟負擔，也加重了全社會的負擔。角膜移植是角膜病盲患者恢復視力和復明的唯一希望，但由于我國角膜捐獻數量極其有限，全國每年能進行的角膜移植手術目前僅有3000余例，致使絕大多數患者因得不到可用的供體角膜而無法重見光明。目前，國內外同類產品主要以羊膜、膠原及其他合成高分子材料用于角膜移植研究，但都存在不同的缺陷。羊膜相對較薄，僅適用于治療眼表淺度損傷。合成材料的透明性和穩定性較差，在降解過程中降解產物可引起局部PH值下降，術區出現非特異性無菌性炎癥反應率較高。膠原是組織工程常用的材料，但純膠原韌性差，易碎，降解過快，手術后一段時間內就發生碎裂，無法達到復明的效果，因此目前仍停留在基礎研究階段。相比而言，異種角膜基質材料來源豐富，具有與正常角膜基質相似的組織結構，移植之后角膜基質的厚度、屈光度不變。天然的角膜基質層存在著某些生長因子，可促進細胞的生長、繁殖和分化，而且免疫原性低，神經 可以長入，有利于角膜知覺的恢復。此外，由于異種移植供體來源的動物，如豬，在生理上與人類具有高度相似性，故其組織或器官被認為是理想的供體之一，以豬作為異種移植供體來源的研究比較深入，豬的組織器官(如心臟瓣膜、胰島細胞、凝血因子等)已用于人類疾病的治療，異體脫細胞真皮基質已被批準用于臨床。豬角膜基質含有角膜細胞生長所必需的I型膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白等細胞外基質成分，具有良好的生物相容性，能夠成為有效的角膜基質替代物。異種移植供體來源的動物(如豬)的角膜基質組織中含有自身固有的細胞，需經過脫細胞處理才能獲得無免疫原性或免疫原性較低的角膜基質替代物?，F有的角膜基質替代物主要通過將動物源性角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌處理獲得，且酶消化一般采用含有胰酶的緩沖液進行處理。這樣的方法對制備得到的角膜基質替代物的膠原板層結構破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較低，并不能完全滿足臨床移植的要求。因此，研發一種能夠完全脫除異種移植供體來源的動物(如豬)角膜基質中的細胞成分，對膠原板層結構破壞極小，使所得角膜基質的板層結構保留完整且膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規則且透光率較高的角膜基質替代物的制備方法，具有重要的現實意義和廣闊的應用前景。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有方法對制備得到的角膜基質替代物的膠原板層結構破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較低，并不能完全滿足臨床移植要求的缺陷，提供一種膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規則且透光率較高的板層角膜基質支架及其制備方法和應用。本專利技術的專利技術人在研究中意外發現，在制備板層角膜基質支架時，采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行酶消化處理，并在酶消化處理之后干燥處理之前進行超聲處理，不僅能夠完全脫除角膜基質中的細胞成分，而且能夠最大程度地減少對角膜基質膠原板層結構的破壞，使所得角膜基質的板層結構保留完整且膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規則、透光率高，與人角膜基質細胞具有理想的生物相容性，能夠最大程度地滿足移植要求。因此，為了實現上述目的，第一方面，本專利技術提供了一種板層角膜基質支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理，并在酶消化處理后進行超聲處理，然后再進行干燥和滅菌處理。第二方面，本專利技術提供了所述方法制備得到的板層角膜基質支架。第三方面，本專利技術還提供了所述板層角膜基質支架在作為角膜基質替代物中的應用。 本專利技術的板層角膜基質支架，來源豐富，生物相容性及生物安全性好，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整；理化性能良好，角膜透光率為70% -80% ;機械強度高，能夠耐受手術縫線牽拉、韌性良好并能長期應用于臨床，主要用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、疤痕、化學或熱燒傷等致盲性眼病，將病變處被損壞的角膜切除并將同樣尺寸的板層角膜基質支架植入患者眼中，能夠達到構建健康角膜組織、改善患者視力的效果。本專利技術方法中，為了最大程度地使支架材料滿足移植要求，對各步驟的條件包括時間、溫度、酶種類選擇及酶濃度、超聲頻率及超聲時間等進行了詳細周密的設計和嚴格反復的驗證。通過一系列實驗的優化，使本專利技術的方法具有以下特點:I)本專利技術方法的工藝流程簡單可靠，周期短。2)本專利技術方法采用的原料來源廣泛，成本低，使用方便。3)本專利技術的方法，最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列整齊，無細胞殘留，前彈力層及基底膜都保留，便于上皮層的生長，提高了支架材料的生物相容性。4)本專利技術方法制備得到的板層角膜基質支架，通過自檢、型式檢驗驗證了該產品的安全性，結果顯示其機械性能、理化性能及生物學性能都滿足臨床移植的要求。5)本專利技術方法制備得到的板層角膜基質支架，適合用于基質層異常角膜的臨床移植，使眾多角膜基質異常患者重見光明成為可能，為組織工程角膜產業提供了重要的技術支持。本專利技術的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明?！靖綀D說明】圖1是本專利技術實施例1制備得到的板層角膜基質支架的冰凍切片圖。圖2是正常人角膜板層結構的冰凍切片圖。圖3是本專利技術對比例I制備得到的板層角膜基質支架的冰凍切片圖。圖4是本專利技術對比例2制備得到的板層角膜基質支架的冰凍切片圖?！揪唧w實施方式】 以下對本專利技術的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。第一方面，本專利技術提供了一種板層角膜基質支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其中，酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理，并在酶消化處理后進行超聲處理，然后再進行干燥和滅菌處理。根據本專利技術的方法，本領域技術人員可以理解的是，在無菌條件下切取角膜基質片前，一般先將新鮮動物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS緩沖液可以為I XPBS緩沖液。對于酒精和妥布霉素的濃度以及浸泡時間沒有特別的要求，可以為本領域常用的濃度和浸泡時間。優選情況下，酒精的體積百分濃度為70-80%，進一步優選為75% ;妥布霉素的濃度為30000-50000U/L，進一步優選為40000U/L ;浸泡時間為10_30s。對于切取的角膜基質片的直徑和厚度沒有特別的要求，可以為本領域常規的角膜基質片的直徑和厚度。優選情況下，切取的角膜基質片的直徑為8-10mm，厚度為200-600 μ mD為了提高制得的板層角膜基質支架和人角膜基質細胞的生物相容性，優選情本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種板層角膜基質支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理，并在酶消化處理后進行超聲處理，然后再進行干燥和滅菌處理。

【技術特征摘要】
1.一種板層角膜基質支架的制備方法，將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌處理，其特征在于，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理，并在酶消化處理后進行超聲處理，然后再進行干燥和滅菌處理。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述酶消化處理的條件包括:DNA酶與緩沖液的體積比為1:500-1500, RNA酶與緩沖液的體積比為1:1500-2500，溫度為30_40°C，時間為2—4h03.根據權利要求1所述的方法，其中，所述超聲處理的條件包括:溫度為20-40°C，超聲功率為200-500W，超聲時間為2-5h。4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述在無菌條件下切取新鮮動物眼球的角膜基質片的方法包括:先將新鮮動物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡，再在無菌條件下切取角膜基質片；所述酒精的體積百分濃度優選為70-80%，所述妥布霉素的濃度優選為30000-50000U/L，所述浸泡時間優選為10_30s ;所述切取的角膜基質片的直徑優選為8-10mm，厚度優選為200-600 μ m ;所述動物優選為豬、?；蚝?..

【專利技術屬性】
技術研發人員：李青，王寶泉，彭艷婷，王紅梅，李海燕，
申請(專利權)人：青島中皓生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37