一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法技術

本發明專利技術公開了一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法。本發明專利技術所提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法，包括以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂反應物的步驟，所述蛋白質，是如下a)或b)的蛋白質：a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4的蛋白質；b)將SEQ?ID?No.2或SEQ?ID?No.4的蛋白質所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。實驗證明本發明專利技術提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法具有較強的實用性。

【技術實現步驟摘要】
—種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法
本專利技術涉及生物
中。
技術介紹
單唾液酸四己糖神經節苷脂(GMl)被證明具有顯著的神經修護及再生活性，是神經退行性疾病或神經損傷的良好的治療藥物，目前已被應用于阿爾茨海默癥、帕金森癥等疾病的治療中。由于生產技術的制約，GMl的價格非常昂貴，而在神經系統疾病中，GMl用藥周期較長，一個療程最少也要三個月，如此一來，治療費用大幅增加，導致GMl普遍應用受到限制。目前，GMl的生產主要是從動物腦組織，如豬腦、牛腦中進行提取。提取時用到大量的氯仿、甲醇等有機試劑，造成了環境污染。此外，由于豬腦組織的神經節苷脂(gangliosides,GLS)中，GMl的含量較低，僅為10-20%，大部分是多唾液酸神經節苷脂，如⑶la、⑶lb、⑶3和GTlb等。直接提取時大部分的多唾液酸神經節苷脂被當作廢棄物丟棄掉，最后提取得到的GMl還不到神經節苷脂總脂的10%，一方面造成了豬腦原材料的浪費，另一方面也增加了成本。豬腦中多唾液酸神經節苷脂⑶la、⑶Ib和GTlb的含量占總神經節苷脂的50-60%。對比各種神經節苷脂的結構可知，GMl可通過水解⑶la，⑶Ib和GTlb的唾液酸殘基得到。以往，有研究者通過部分酸水解豬腦神經節苷脂(gangliosides，GLS)來制備GMl0但酸水解的穩定性差，不同批次之間質量不穩定。此外，酸水解的專一性差，容易產生副產物，造成了 GMl產率偏低，且后續的產品分離純化比較困難。也有研究者利用GLS作為誘導劑，與唾液酸水解酶產生細菌共同培養，通過這些細菌分泌的唾液酸水解酶來生物轉化GLS，制備GM1。生物轉化與酸水解相比，具有條件溫和、專一性好等優越性。但是由于細菌分泌的唾液酸水解酶一般是誘導酶，即使用GLS進行誘導，分泌的唾液酸水解酶的量也非常少，造成了這一生物轉化過程的效率很低，這一生產過程不適合放大，不適用于工業規模的應用。此外，細菌菌種容易出現退化、變異等問題，給生產過程增添了不穩定性?，F在急需通過基因工程的手段，直接克隆和表達所需要的酶的基因，實現GMl的穩定制備。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的方法。本專利技術提供的制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的方法，包括以神經節苷脂GLS為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl反應物的步驟，所述蛋白質的名稱為Cce sia-Ι,來源于纖維菌(Cellulosimicrobium sp.)21,是如下a)或b)或c)的蛋白質:a)氨基酸序列是SEQ ID N0.2的蛋白質；b)氨基 酸序列是SEQ ID N0.4的蛋白質；c)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質；d)將SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。其中，SEQ ID N0.2由703個氨基酸殘基組成，是天然唾液酸水解酶Cce sia_l (名稱為N Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4由724個氨基酸殘基組成，是重組唾液酸水解酶Cce sia-Ι (名稱為R Cce sia-Ι)的氨基酸序列；SEQ ID N0.4是在SEQ ID N0.2的氨基末端添加氨基酸序列:MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM得到的氨基酸序列。上述c)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ IDN0.1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID N0.1所示的信號肽的編碼序列得到。上述d)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述d)中的蛋白質的編碼基因可通過將SEQ IDN0.3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上SEQ ID N0.3所示的His-Tag的編碼序列得到。上述方法中，所述方法包括從所述反應物中純化得到單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的步驟。上述方法中，所述以神經節苷脂為底物用Cce sia-Ι進行催化反應在液體中進行，所述液體中Cce sia-Ι 和所述神經節苷脂的配比為IIU Cce sia_l:0.5_2mg所述神經節苷脂(如0.84IU Cce sia-1:lmg所述神經節苷脂)，所述IU為Cce sia-Ι的唾液酸水解酶酶活。上述方法中，所述催化反應進行1-3小時，所述1-3小時可為1-2小時或1.5-2小時或2-3小時或2-2.5小時或2小時。上述方法中，所述催化反應在30-42°C，所述30-42°C可為30-37°C或37-42 °C或37。。。上述方法中，所述純化包括以下步驟:將所述反應物進行離心，使單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl進入上清液中，收集上清液，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的上清液，將所述上清液干燥，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的干燥粉，除去所述干燥粉中的雜質，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。上述方法中，除去所述干燥粉中的雜質包括以下步驟:將所述干燥粉溶于溶液A中，得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的液體混合物，將所述液體混合物進行硅膠柱層析，用所述溶液A洗脫，收集含有單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl的級分，將所述級分干燥，得到單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。上述方法中，所述離心在常溫、6000rpm條件下進行IOmin ;所述溶液A由氯仿和甲醇組成，所述溶液A中氯仿和甲醇的體積比為5:4。Cce sia-Ι在制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl中的應用也在本專利技術的保護范圍，如Cce sia-Ι生物轉化神經節苷脂(GLS)和/或GDla和/或GDlb和/或GTlb制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。與Cce sia-Ι相關的生物材料在制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl中的應用也在本專利技術的保護范圍，如所述生物材料生物轉化神經節苷脂(GLS)和/或GDla和/或GDlb和/或GTlb制備單唾液酸四己糖神經節苷脂GMl。所述生物材料為下述BI)至B16)中的任一種:BI)編碼Cce sia-Ι的核酸分子；B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒；B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體；B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；B5)含有BI)所述核酸分子的重組微生物；B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物； B9)含有BI)所述核酸分子的轉基因動物細胞系；B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；Bll)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；B12)含有B4)所述重組載體的轉基因動物細胞系；B13)含有BI)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；B16)含有B4)所述重組載體的轉基本文檔來自技高網...

【技術保護點】
制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法，包括以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂反應物的步驟，所述蛋白質，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質：a)氨基酸序列是SEQ?ID?No.2的蛋白質；b)氨基酸序列是SEQ?ID?No.4的蛋白質；c)將SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質；d)將SEQ?ID?No.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。

【技術特征摘要】
1.制備單唾液酸四己糖神經節苷脂的方法，包括以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應得到含有單唾液酸四己糖神經節苷脂反應物的步驟，所述蛋白質，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質: a)氨基酸序列是SEQID N0.2的蛋白質； b)氨基酸序列是SEQID N0.4的蛋白質； c)將SEQID N0.2所示的氨基酸 序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質； d)將SEQID N0.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有唾液酸水解酶活性的蛋白質。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法包括從所述反應物中純化得到單唾液酸四己糖神經節苷脂的步驟。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述以神經節苷脂為底物用蛋白質進行催化反應在液體中進行，所述液體中所述蛋白質和所述神經節苷脂的配比為IIU所述蛋白質:0.5-2mg所述神經節苷脂,所述IU為所述蛋白質的唾液酸水解酶酶活。4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述催化反應進行1-3小時，所述催化反應在30-42 °C。5.根據權利要求...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周義發，高娟，原野，及莉，冷佳益，陳紅磊，臺桂花，
申請(專利權)人：東北師范大學，
類型：發明
國別省市：吉林;22