丹參酮ⅡA的新用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及丹參酮ⅡA在制備皮膚癌治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)將多個劑量的丹參酮ⅡA在人角質(zhì)形成細(xì)胞系接受長波紫外線的照射后加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，研究不同劑量丹參酮ⅡA在長波紫外線引起的損傷細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。該項發(fā)明專利技術(shù)建立在實驗性細(xì)胞損傷模型的基礎(chǔ)上，為研究皮膚癌細(xì)胞凋亡的信號通路機(jī)制及研發(fā)治療皮膚癌的天然產(chǎn)物藥物提供了依據(jù)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
丹參酮II A的新用途
本專利技術(shù)涉及丹參酮II A在制備皮膚癌治療藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
皮膚癌分為皮膚黑素瘤和非黑素瘤性皮膚癌。在白色人種的發(fā)病率居各種腫瘤之首，隨著臭氧層被破壞，亞洲人的發(fā)病率也在增加。紫外線是引起皮膚癌的最主要原因，促進(jìn)被紫外線損傷和癌變的皮膚細(xì)胞凋亡是預(yù)防和治療皮膚癌的有效手段之一。為了模擬因 紫外線引起的皮膚損傷或者癌變，前人建立了不同皮膚細(xì)胞在長波紫外線(UVA)或者中波紫外線(UVB)下的損傷模型。其中UVB因其能量較高，能大幅度的損傷皮膚細(xì)胞，但是因其波長短，在臭氧層中大部分被吸收，所以到達(dá)地面的UVB甚少。而UVA相對能量較低，但是因其波長較長，大部分穿透大氣層到達(dá)地表，甚至在陰天和室內(nèi)也有大量的UVA照射到人的皮膚上。角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚表層最主要的細(xì)胞，其健康程度直接影響著其他皮膚細(xì)胞的功能和狀態(tài)。始于1988年建立起來的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT經(jīng)常用于皮膚類藥品的藥理研究，是很好的正常角質(zhì)形成細(xì)胞的替代物，具有普通角質(zhì)形成細(xì)胞的形態(tài)和表皮分化能力，并且在普通狀態(tài)下沒有腫瘤生成趨勢。我們利用UVA和HaCaT細(xì)胞來建立皮膚細(xì)胞光損傷模型，可模擬皮膚癌的發(fā)病機(jī)制，為篩選新型預(yù)防治療皮膚癌的藥物提供良好的研究載體。丹參酮II A是從傳統(tǒng)中藥丹參根中提取的菲醌類衍生物，分子式為C19O3H2tl,經(jīng)常用于心絞痛的治療，改善胸悶和缺氧后引起的心肌代謝紊亂，在皮膚病方面，也只用于痤瘡的治療。丹參酮II A對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷、誘導(dǎo)分化和凋亡的作用。有關(guān)研究也表明其可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，在肺癌細(xì)胞中，丹參酮II A可以提高凋亡基因的表達(dá)水平、降低抑制凋亡基因的表達(dá)水平，從而達(dá)到治療肺癌的目的。然而其在皮膚癌預(yù)防和治療方面的應(yīng)用卻沒有。因傳統(tǒng)中藥越來越被現(xiàn)代人所推崇，其中提取的天然產(chǎn)物將具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種丹參酮II A在制備治療皮膚癌天然藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)將丹參酮II A在UVA照射后加入HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)基中，24小時后用細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8)檢測細(xì)胞活性。結(jié)果證明，相比單獨用丹參酮II A和單獨用UVA照射的細(xì)胞，在UVA照射過后加入丹參酮II A的細(xì)胞其活性大大降低，并且不同濃度的丹參酮II A均可以有效的加劇UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降。本專利技術(shù)將丹參酮II A加入HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)基中，24小時后用UVA照射細(xì)胞并在30分鐘后提取細(xì)胞總蛋白并用Western Blotting法檢測凋亡相關(guān)信號通路蛋白(p38和JNK)的磷酸化水平。結(jié)果證明，相比單獨用丹參酮II A處理和單獨用UVA照射的細(xì)胞，加入丹參酮II A并照射UVA的細(xì)胞其p38和JNK的磷酸化水平有較大的提高。本專利技術(shù)新穎之處和優(yōu)點在于:1)UVA損傷模型建立方法簡單； 2)UVA損傷模型的建立為皮膚癌的預(yù)防和治療提供了有效的研究平臺； 3)丹參酮IIA易于獲取，有利于新藥規(guī)模化生產(chǎn)； 4)丹參酮IIA被人們所熟知，易于推廣； 5)丹參酮IIA經(jīng)多年臨床檢驗，毒副作用小。【附圖說明】圖1為不同濃度的丹參酮II A對細(xì)胞活力的影響。圖2為不同濃度的丹參酮II A促進(jìn)2 J/cm2的UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡； 圖3為不同濃度的丹參酮II A促進(jìn)2 J/cm2的UVA誘導(dǎo)的胞內(nèi)磷酸化p38和磷酸化JNK的表達(dá)； 圖4為不同濃度的丹參酮II A促進(jìn)20 J/cm2的UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。【具體實施方式】實施例 一:不同劑量丹參酮II A加速2 J/cm2的UVA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基(DMEMW 10%滅活胎牛血清，100 U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素)于37°C、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，細(xì)胞以0.25%胰酶消化并按1:3傳代并接種于12孔板，待細(xì)胞完全融合時進(jìn)行實驗。丹參酮II A溶于二甲基亞砜，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。HaCaT細(xì)胞更換常規(guī)完全培養(yǎng)基為含有不同濃度丹參酮II A的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)24小時。用DPBS沖洗2次并棄去DPBS，每個孔加入0.5 mL混有CCK8的完全培養(yǎng)基(CCK8:DMEM =1:10)于37°C、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)2小時后每個孔吸取100 μL上清至96孔板，在450 nm的波長下讀取吸光值，詳情見圖1。選取無細(xì)胞毒性的低濃度丹參酮II A進(jìn)行后續(xù)實驗。融合后的細(xì)胞分為對照組、僅UVA處理組、丹參酮II A和UVA共同處理組。照射前棄去培養(yǎng)基，用DPBS漂洗2次；重新向所有孔中加入0.5 mL DPBS。2 J/cm2的UVA照射時，細(xì)胞培養(yǎng)板距紫外燈管15 cm并置于紫外輻照儀內(nèi)部中央。對照組和僅丹參酮II A處理組用錫箔紙蓋住，照射后DPBS由加有不同濃度丹參酮II A (8.5、17、34μΜ)的完全培養(yǎng)基替換并繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用DPBS沖洗細(xì)胞2次，棄去DPBS后每個孔加入0.5 mL混有CCK8的DMEM完全培養(yǎng)基(CCK8:DMEM =1:10)于37°C、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)2小時后每個孔吸取100 μL上清至96孔板，在450 nm的波長下讀取吸光值并計算其相對細(xì)胞活力。詳情見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮II A可以加劇UVA照射后細(xì)胞活力的下降，并且隨著濃度的升高細(xì)胞活力隨之降低。經(jīng)8.5 μΜ的丹參酮II A處理過的細(xì)胞對比僅UVA照射組,細(xì)胞活力沒有顯著差異；經(jīng)17 μΜ的丹參酮II A處理過的細(xì)胞對比僅UVA照射組，細(xì)胞活力下降了 20% ；經(jīng)34 μΜ的丹參酮II A處理過的細(xì)胞對比僅UVA照射組，細(xì)胞活力更是下降了 33%。丹參酮II A可以有效的促進(jìn)被UVA損傷的細(xì)胞凋亡。實施例二:不同劑量丹參酮II A促進(jìn)2 J/cm2的UVA誘導(dǎo)的胞內(nèi)磷酸化p38和磷酸化JNK的表達(dá) HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM加10%滅活胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)于37°C、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，細(xì)胞以0.25%胰酶消化并按1:3傳代并接種于12孔板，待細(xì)胞完全融合時進(jìn)行實驗并分為對照組、僅丹參酮II A處理組、僅UVA處理組、丹參酮II A和UVA共同處理組。照射前24小時在對應(yīng)細(xì)胞組內(nèi)加入8.5、17、34μΜ丹參酮II Α，照射前棄去培養(yǎng)基，用DPBS漂洗2次；重新向所有孔中加入0.5 mL DPBS。2 J/cm2的UVA照射時，細(xì)胞培養(yǎng)板距紫外燈管15 cm并置于紫外輻照儀內(nèi)部中央。對照組和僅丹參酮II A處理組用錫箔紙蓋住，照射后DPBS由完全培養(yǎng)基代替，繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘后提取總蛋白并用蛋白質(zhì)印跡法檢測磷酸化及總p38、JNK信號通路蛋白，詳情見圖3。印跡圖像用軟件Image J分析灰度值,并用Ρ_ρ38/ β -actin、P-JNK/ β -actin和P-Erk/ β -actin衡量其磷酸化水平,其中β -actin為肌動蛋白，作為內(nèi)參。具體如下表:本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
丹參酮ⅡA在制備皮膚癌治療藥物中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】
1.丹參酮II A在制備...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：翁新楚，史維剛，
申請(專利權(quán))人：上海大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31