單倍體細胞制造技術

本發明專利技術涉及產生穩定的單倍體細胞培養物，所述細胞在正向及反向遺傳學中的用途，尤其鑒定與修飾的表型關聯的靶基因和尤其是鑒定與毒素抗性，尤其蓖麻毒素毒性抗性關聯的基因靶，及靶化合物的治療性用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利摘要】本專利技術涉及產生穩定的單倍體細胞培養物，所述細胞在正向及反向遺傳學中的用途，尤其鑒定與修飾的表型關聯的靶基因和尤其是鑒定與毒素抗性，尤其蓖麻毒素毒性抗性關聯的基因靶，及靶化合物的治療性用途。【專利說明】單倍體細胞【
】本專利技術涉及單倍體細胞和它們作為遺傳篩選工具的用途，以及與細胞存活和毒素抗性關聯的新鑒定的基因。【
技術介紹
】復雜生物的二倍體基因組嚴重限制在模型物種研究中、而且在人研究中的許多遺傳方法。一些生物(諸如酵母或社會昆蟲)是單倍體，即它們攜帶單組染色體(Otto和Jarne, 2001)。酵母的單倍性已被利用鑒定生物學的根本性的機理(HartwelI等人，1974)。但是，全部體細胞哺乳動物細胞攜帶2個拷貝的染色體，即呈現使突變篩選不明了的二倍性。具有它們的基因組的單拷貝的生物，諸如酵母，提供遺傳分析的基礎，其中必要的基因的任何隱性突變會由于第2基因拷貝的缺失而顯示清楚的表型(Hartwell等人，loc.cit.)。最近已顯示，單倍體哺乳動物細胞允許正向遺傳篩選(Carette等人，2009, 2011a, 2011b)。但是，證明了難在哺乳動物中產生體細胞單倍體細胞，可能因為單倍性與哺乳動物發育不相容(Latham等人，2002)。至今，已在魚胚胎干細胞(Yi等人，2009)、人KBM-7白血病細胞(Carette等人，2009，2011a)中達到單倍性，及通過電融合產生雜交細胞(Yan等人，2000)。嘗試自單倍體小鼠胚胎建立多能干細胞系導致了具有二倍體核型的單性生殖胚胎干細胞的分離(Kaufman等人，1983)。這些研究報道了具有定義的內細胞團的明顯正常單倍體小鼠胚泡的發育(Kaufman等人，1983 ;Latham等人，2002)。Kaufman等人(1983)描述活化鼠卵母細胞的方法,其發育成單倍體和二倍體干細胞的混合物。但是單倍體細胞無法穩定地培養及培養物立即轉變為全部二倍體狀態。W02008/0334 69A1描述產生具有二倍體、雜合基因組的單性生殖胚胎干細胞的方法。這些細胞與特定供體匹配和可用于移植物。W001/32015A1涉及分離單倍體細胞，尤其從二倍體卵母細胞(例如在受精或導入雌性原核之后)產生的細胞的方法，其中半數染色體然后在極體中被擠出。將該單倍體細胞轉化為二倍體細胞，例如通過電融合或注射另一單倍體基因組，從而形成二倍體細胞。Leeb等人(2011)描述哺乳動物單倍體胚胎干-樣細胞培養物的產生。盡管模型生物中功能損失遺傳篩選闡明了多種生物學過程，哺乳動物細胞的二倍體基因組至今阻止了大規?；蚱茐?。鑒于此，會高度期望允許哺乳動物中的隱性遺傳學的高-通量方法的手段和方法，但是尚未可利用?！?br>技術實現思路
】因此，本專利技術解決的技術問題可本認為是提供滿足上述需求的手段和方法。所述技術問題由在權利要求中及在下文表征的實施方式解決。尤其，本專利技術的目標是提供單倍體干細胞的培養物和產生該細胞的方法。該細胞應穩定足夠的時間量，這允許在正向及反向遺傳學實驗期間操作和分析。這些目標由本專利技術解決，本專利技術提供產生單倍體細胞的哺乳動物細胞或細胞系的方法，包括獲得多個處于發育的多細胞胚胎階段，優選胚泡階段的單倍體細胞，分離所述多個細胞，擴增分離的所述多個細胞，自所述擴增的細胞選擇及分離一個或更多具有單倍體基因組的單細胞，由此獲得穩定的單倍體細胞的細胞系的細胞。任選地，可將若干個分離的細胞組合成細胞培養物。或者，各個體細胞可增殖及生長為細胞培養物(亞克隆)。本專利技術還涉及產生源于單性生殖桑椹胚或胚泡的單倍體胚胎干細胞系的方法，該方法包括:(a)自雌性受試者體外活化非-受精的卵母細胞，以誘導單性生殖發育；(b)培養所述步驟(a)的活化的卵母細胞，以產生桑椹胚和/或胚泡；(C)自所述步驟(C)的桑椹胚和/或胚泡分離胚胎干細胞及，任選地，將所述胚胎干細胞轉移進抑制所述胚胎干細胞分化的細胞培養基；(d)使步驟(C)的胚胎干細胞經歷FACS分析及鑒定和/或富集顯示單倍體DNA內含物的胚胎干細胞；及(e)任選地，顯示單倍體DNA內含物的胚胎干細胞的重復的FACS純化和所述胚胎干細胞的擴增，由此產生單倍體胚胎干細胞系。也提供的是可由專利技術的方法和其優選的變體獲得的或由專利技術的方法和其優選的變體獲得的具有單倍體基因組的細胞的細胞培養物。本專利技術還涉及由上述的方法產生的單倍體胚胎干細胞系。此外，本專利技術提供桑椹胚來源的或胚泡來源的胚胎干-樣細胞系，其包含至少60%單倍體胚胎干細胞，以及提供使用所述單倍體胚胎干細胞的試劑盒及測試系統。此外，本專利技術涉及單倍體干細胞的方法和用途以及源于該方法和用途的產物。該新用途和方法不限于使用創新地產生的及改善的干細胞，但也可使用現有單倍體干細胞。本專利技術的再一方面在權利要求中描述及定義。發育的多細胞胚胎階段的多個單倍體細胞可從可以單倍體狀態單性生殖地增殖的活化的卵母細胞得到。在優選的實施方式中，本專利技術的方法包括下列步驟:獲得哺乳動物的單倍體單性生殖卵母細胞或單倍體胚胎細胞，將所述卵母細胞或胚胎細胞轉移進假孕雌性，使所述卵母細胞或胚胎細胞生長至多細胞階段，任選地將所述多細胞階段的細胞培養至胚泡階段，由此提供處于發育的多細胞胚胎階段的所述多個單倍體細胞。在進一步步驟中，方法可包括:獲得所述多細胞階段的細胞，擴增所述多細胞階段的細胞(例如作為培養物簡單維持，尤其以分離的形式，無擴增也是可能的)，自所述擴增的細胞選擇及分離具有單倍體基因組的單細胞，使所述細胞擴增至細胞培養物，由此獲得穩定的單倍體細胞的細胞系。方法的第I步驟包括獲得單倍體單性生殖卵母細胞或胚胎細胞。此可由本領域知道的常用方法，例如通過由醇或鍶處理活化卵母細胞來進行。活化的細胞能增殖及含有僅一個基因組拷貝(單倍性)。單倍性涉及在細胞周期的Gl或GO期期間每細胞僅存在一個基因組拷貝(In)。專利技術的單倍體細胞能在S期復制基因組，在G2期建立基因組的第2拷貝(2n)。在G2期此拷貝的基因組是純合的。單倍性可區別于二倍性，在Gl或GO期期間具有2個基因組(通常雜合)，和在S期之后在G2期期間具有4個基因組。最終導致建立的單倍體細胞培養物的全部專利技術的細胞在方法的全部步驟期間維持單倍性。一些細胞可獲得二倍體基因組。將這些細胞選擇性地移除。活化的卵母細胞可在假孕雌性中生長，其中所述細胞生長至多細胞階段，諸如囊胚或桑椹胚階段。假孕雌性中的生長優化活化的卵母細胞以早期胚胎-樣發育成單倍體細胞，用于培養?；蛘?，細胞可如Leeb (2011)描述培養。可分離多細胞階段的細胞，并且也可體內或體外進一步生長。在所述進一步生長步驟中，所述多細胞階段的多個細胞可進一步擴增和/或發育，包括至囊胚階段。盡管單倍體細胞無法完成胚胎發育同時維持單倍性，發育的早期階段是可能的。根據本專利技術，該胚胎-樣多細胞聚集體可為發育的胚胎階段的多個單倍體細胞。在該階段，在所述多個細胞之內細胞由細胞間鍵附接。該多個細胞可新產生或，例如自冷凍的供給提供。替代性地，自該多個細胞或多細胞階段，諸如單倍體單性生殖胚胎-樣階段簡單獲得分離的細胞也是可能的。在下一步，分離及擴增來自所述多細胞階段的多個細胞的一個或更多細胞。自多細胞階段的細胞分離通常涉及將多細胞階段分離為本文檔來自技高網...

【技術保護點】
產生單倍體細胞的哺乳動物細胞系的方法，包括在發育的聚集胚胎階段，優選胚泡階段，獲得多個單倍體細胞，分離所述多個細胞，擴增分離的所述多個細胞，自所述擴增的細胞選擇及分離一個或更多具有單倍體基因組的單細胞，由此獲得穩定單倍體細胞的細胞系的細胞。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：U·艾林，J·彭寧格，J·陶貝茨米德，
申請(專利權)人：分子生物技術院有限公司，
類型：發明
國別省市：奧地利;AT