一種基于膠乳的三聚氰胺快速檢測方法及試劑盒技術

本發明專利技術公開了包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液及其制備方法，包含包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的試劑盒，以及使用包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液檢測樣品中三聚氰胺的方法。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液及其制備方法，包含包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的試劑盒，以及使用包被有三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液檢測樣品中三聚氰胺的方法。【專利說明】一種基于膠乳的三聚氰胺快速檢測方法及試劑盒
本專利技術涉及免疫學、醫學、生物學和食品安全的交叉學科領域，更具體涉及一種基于聚苯乙烯膠乳微球檢測三聚氰胺的方法。
技術介紹
在食品行業中，通過凱式定氮法(GB/T5009.5-2010 ;第一法)測定氮原子含量從而間接計算蛋白質含量。近年來，一些不法商販將化工原料三聚氰胺添加到食品或飼料中，以求提高通過凱式定氮法測定的表觀蛋白含量。三聚氰胺可導致人體泌尿系統產生結石，如膀胱結石和腎結石等疾病，因此被嚴格禁止添加到食品中。目前三聚氰胺的檢測方法有高效液相色譜法、液質聯用、氣質聯用法等，這些方法雖然檢測靈敏度高，但前處理步驟操作時間長，儀器價格昂貴，且需取樣并送回實驗室進行檢測，不適合樣品中三聚氰胺的現場快速篩查。目前可用于現場快速檢測的方法如酶聯免疫吸附試驗，相較之下應用起來較靈活，但檢測成本依然很貴，對技術操作人員操作也有一定的技術要求，而膠體金卡雖然操作十分簡便、但只能是定性分析，不能實現準確的定量分析。免疫比濁法(J.M.Singer et al.，Am.J.Med.21，888-92; 1956)主要用于微生物和病毒感染等的檢測和臨床診斷。在免疫比濁法中，將抗體包被在微球表面。當包含特定抗原的樣品與乳膠懸液混合時，導致可見的凝集，增加了樣品的渾濁度。通過測量樣品與抗體包被乳膠懸液反應后的吸光度，并與使用已知濃度的抗原繪制的標準曲線進行比較，從而測定樣品中抗原的濃度。免疫比濁法中使用的微球包括多種類型，例如玻璃、硅石、納米金屬、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺顆粒等。可通過被動吸附或化學共價偶聯，例如碳化二亞胺(EDC)法、溴化偶聯等方式將抗體連接到微球上。在膠乳微球表面包被抗體的方法通常需要首先活化膠乳微球表面的官能團，使其能夠與抗體蛋白反應。例如，通常使用EDC活化膠乳微球表面的羧基，使其與蛋白質的氨基偶聯。通常認為通過使用碳化二亞胺(EDC)/N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)的活化法更有利于蛋白質與微球之間的相互作用，因此是最為常用的偶聯方法。此外，還有使用EDC/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)混合物的活化法。然而，這兩種方法中要先后使用兩種試劑，反應系統和方法較為復雜，極易導致微球發生凝集，不利于抗體包被微球的工業化生產。與此相比，單獨使用EDC的活化法(或稱作一步EDC法)的步驟較為簡單且產率較高。然而，一步EDC法多用于不包含羧基的配體(例如寡核苷酸，如DNA)與表面帶有羧基的微球之間的偶聯。如果待偶聯的配體也包含羧基基團(例如蛋白質，如抗體)，其可能被EDC活化，導致配體之間的聚合，從而無法獲得期望的產物。因此，需要開發一種避免微球或抗體之間相互凝集產生沉淀，從而適合穩定生產抗體包被微球的生產工藝，從而獲得能夠利用免疫比濁法快速、準確檢測樣品中的三聚氰胺。
技術實現思路
目前，EDC活化法中多使用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)作為活化緩沖劑，但本專利技術人經實驗發現使用MES緩沖的EDC溶液無法制備包被三聚氰胺抗體的微球溶液。本專利技術人經大量實驗表明，在膠乳體系中，加入活化液后極易使帶羧基的微球相互凝集產生沉淀，保持膠乳狀態則需要改進活化緩沖液的成分。因此，本專利技術人對EDC活化法進行了大量研究，結果發現包含吐溫20的磷酸鹽緩沖液能夠提供有利于抗體與微球之間偶聯的最適環境，能夠避免微球相互凝集產生沉淀，適合穩定生產抗體包被微球，從而完成了本專利技術。在第一方面，本專利技術提供了一種包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的制備方法，所述方法包括以下步驟:將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩沖液中，其中，所述活化緩沖液為包含0.5?1.0g/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4-7.8。在優選的實施方案中，本專利技術的制備方法使用一步EDC活化法活化所述膠乳微球表面的羧基。在本專利技術中，術語“一步EDC活化法”是指在活化過程中不使用除碳化二亞胺外的其他活化劑的EDC活化法。所述“其他活化劑”包括諸如Sulfo-NHS、NHS的試劑。在一個【具體實施方式】中，本專利技術的制備方法包括以下步驟:I)將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩沖液中，其中，所述活化緩沖液為包含0.5?L Og/L吐溫20的10?40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4-7.8。2)加入活化劑混合反應，其中所述活化劑為碳化二亞胺；3)加入三聚氰胺單克隆抗體，進行包被反應；4)加入淬滅液終止反應；5)加入封閉液以封閉游離的羧基，從而獲得包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。在本專利技術中，所述膠乳微球可以是通常用于免疫檢測的任何膠乳微球，例如聚苯乙烯微球、聚丙烯酰胺微球等。已知有很多廠商提供各種不同型號的膠乳微球，例如Microparticles GmbH,PolyMicrospheres Inc.等。本領域技術人員可以根據具體需要選擇適合的表面帶有羧基的膠乳微球。在本專利技術中，優選使用聚苯乙烯膠乳微球。本專利技術所述膠乳微球的粒徑可以在100-200nm之間,優選130_170nm。在本專利技術中，使用表面帶有羧基的膠乳微球,從而通過碳化二亞胺反應與三聚氰胺單克隆抗體連接。所述膠乳微球的羧基含量為100-200 μ eq/g，優選 160 ?170μ eq/g。在本專利技術中，碳化二亞胺的加入量可由本領域技術人員根據具體需要確定。例如，可以加入羧基數量15%-30%的碳化二亞胺。本專利技術使用的三聚氰胺單克隆抗體可以通過本領域已知的方法制備，例如雜交瘤技術等；也可以通過商購獲得，例如購自北京博奧生物技術有限責任公司(型號bsm-2182M)等。在本專利技術中，膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體之間的比例可由本領域技術人員根據具體需要確定。膠乳微球與三聚氰胺單克隆抗體之間的比例通常在5:1至10:1之間，優選10:1。所加入的抗體過多或過少都易導致膠乳微球發生凝集。本專利技術使用的淬滅液可以是通常用于終止碳化二亞胺連接反應的任何試劑，例如60-80g/L甘氨酸,優選75g/L甘氨酸。本專利技術使用的淬滅液可以是通常用于封閉膠乳微球游離的羧基的任何試劑，例如血清白蛋白，如180-220g/L牛血清白蛋白，優選200g/L牛血清白蛋白。由本專利技術所述方法制備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液可以現配現用。在使用時，通過離心去除上清，使用復溶液清洗膠乳微球，并定容至指定的濃度。所述復溶液可以包含8-15g/L甘氨酸、0.5-1.5g/L疊氮鈉、8_13g/L山梨醇、3_8g/L牛血清白蛋白和1.5-2.5g/L EDTA.Na2, ρΗ7.8-8.2。優選地，所述復溶液包含11.26g/L甘氨酸、1.0g/L疊氮鈉、10.0g/L山梨醇、5.0g/L 牛血清白蛋白和 2.0g/L EDTA.Na2, ρΗ8.0。也可以將按照本專利技術所述方法制備的包被三聚氰胺抗體的膠乳微球復溶在所述復溶液中，并在2?8° C下低溫保存。在一個實施方式中，本專利技術所述的制備方法包括以下步驟:I)使用活化緩沖液將粒徑130_170nm，羧基含量為160?170 μ eq/g本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液的制備方法，其包括：1)將表面帶有羧基的膠乳微球稀釋在活化緩沖液中，其中，所述活化緩沖液為包含0.5～1g/L吐溫20的10～40mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4?7.8；2)加入活化劑，混合反應，其中所述活化劑為碳化二亞胺；3)加入三聚氰胺單克隆抗體，進行包被反應；4)加入淬滅液終止反應；和5)加入封閉液以封閉游離的羧基，從而獲得包被三聚氰胺抗體的膠乳微球溶液。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王琳，張小波，鄭清林，
申請(專利權)人：北京普析通用儀器有限責任公司，
類型：發明
國別省市：北京;11