重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白STp5-His、抗該蛋白的單克隆抗體及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素(STp)融合蛋白STp5-His、抗該蛋白的單克隆抗體及其應用，本發明專利技術中所述的融合蛋白STp5-His的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，編碼所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本發明專利技術中豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素STp成熟肽基因(estp)經過4次串聯后表達出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp蛋白具有了良好的免疫原性。本發明專利技術采用細胞融合技術制備出針對該融合蛋白STp5-His和天然STp的特異性單克隆抗體，解決了生產實踐中無法對STp進行檢測的難題，且該特異性單克隆抗體能夠在體外中和天然STp，具有臨床應用的前景。

【技術實現步驟摘要】
重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白STp5-His、抗該蛋白的單克隆抗體及其應用
本專利技術涉及重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白及其應用，具體涉及豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素STp基因(estp)經過4次串聯后表達出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp具有了良好的免疫原性，本專利技術屬于基因工程及免疫學

技術介紹
產腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)是引起幼畜、兒童和旅行者腹瀉的主要病原菌，是造成新生仔豬、犢牛腹瀉的重要病原之一。在家畜中，尤其以初生幼畜特別易感，可造成生長發育遲緩、生產能力低下、嚴重的可以導致死亡，給畜牧業帶來嚴重經濟損失。ETEC毒力因子包括黏附素、腸毒素、水腫病毒素、內毒素、溶血素以及EatA等。其中，腸毒素在ETEC的致病機理中發揮重要作用。腸毒素包括：耐熱腸毒素(heat-stableenterotoxin,ST)和不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin,LT)，其中ST是造成嚴重腹瀉的主要毒力因子之一。根據ST的生物學特性可將其分為：STI(或STa)和STⅡ(或STb)兩類。STa能引起新生仔豬(1～3日齡)和乳鼠腸積水，可導致兒童發生腹瀉；STb只能引起斷乳小豬和兔的腸積水，對乳鼠沒有致病性。STa在ST引起的腹瀉病中占主要地位。根據來源不同，STa分為豬/牛源(STp)和人源(STh)。STp與STh結構相似，有14個氨基酸殘基及3個二硫鍵相同，成熟的STp有18個氨基酸，成熟的STh有19個氨基酸，二者在抗原性上沒有差別，能通過基因探針加以識別。由于STa分子量小(約2Ku)，很難獲得天然純品，且此蛋白不具有免疫原性。STa無法被蛋白質染色劑染色，也不能直接包被到ELISA板上，因此無法采用SDS-PAGE法和ELISA方法對其進行直接檢測，給臨床ETEC的檢測帶來很大困難。由ETEC引起的腹瀉疾病中，ST發揮重要作用，據Rebertson的調查研究表明：20％～30％的ETEC為LT+/ST-；30％～40％的ETEC為LT+/ST+；接近50％的ETEC為LT-/ST+。也就是說在大部分的ETEC引起的嚴重腹瀉中，均有ST的存在，所以對ST進行快速、準確的檢測有利于對腹瀉病的早期診斷，采取有效治療方案，降低經濟損失。據統計，STp是造成新生仔豬和犢牛腹瀉，甚至死亡的重要毒力因子之一。目前對STa的檢測方法是乳鼠灌胃法。將新生BALB/c乳鼠(1～3日齡)隨機分組，將細菌過夜培養物上清中加入2％的伊文斯藍10μl/ml。每只乳鼠灌飼0.1ml，25℃靜止4h后，腹部解剖后取全部腸管，計算灌胃后乳鼠的G/C(腸重/剩余尸重)值進行結果判定，當G/C值≥0.09時，判為STa陽性，G/C值≤0.083時，判為STa陰性，兩者之間判為可疑。該方法與血清學方法相比敏感性較低，需要特定的實驗動物，操作繁瑣，不利于實驗室對STa的快速檢測。因此，制備針對STa的特異性抗體，建立快速、敏感、特異的血清學檢測方法對深入開展ETEC相關研究具有重要的理論和實際意義。由于STa蛋白較小，免疫原性差，單獨免疫后無法刺激動物體產生相應抗體。雖然通過化學方法提純可以獲得品質較高的STa蛋白，但純化工藝復雜，樣品損失量大，因此獲得具有免疫原性的STa蛋白是制備特異性抗體的前提。目前主要有兩種方法獲得具有免疫原性的STa蛋白：(1)基因融合方法：一般選擇將STa基因與其它比較大的載體蛋白基因進行融合，表達融合蛋白，通過這種方法獲得具有免疫原性的STa融合蛋白。例如將STa基因與LTB亞單位基因連接、STa基因與K99基因融合或STa基因與β-半乳糖苷酶基因融合在一起等，其中將STa基因與LTB基因融合進行提高STa免疫原性的研究較多。徐兵等(1999)將ETEC的LTB亞單位基因和ST基因融合并進行了表達，用表達的融合蛋白免疫小鼠后，抗ST的血清抗體效價為免疫前的100倍，抗LTB的血清抗體效價為免疫前的1000倍，由于LTB是強免疫原，所以抗ST的血清抗體效價明顯低于抗LTB血清抗體效價。李敏等(2009)通過PCR和寡核苷酸定點突變技術將STa毒素中心的6個Cys分別突變為Ser和Gly，將突變后的STa與K99菌毛基因連接，表達的融合蛋白能夠被抗ETECC83922的多克隆抗體特異性識別，但是沒有明確說明STa抗體的產生。李書光等(2009)利用基因工程技術構建了k99-estA融合基因及其原核表達載體，并對表達的融合蛋白進行了初步免疫原性分析。結果顯示，用該蛋白免疫動物能夠獲得抗STa蛋白的特異性抗體，乳鼠灌胃實驗證明該抗體能中和天然STa，對乳鼠有保護作用。(2)化學偶聯方法：此方法首先需要純化ST，使其達到同質的標準。然后將其與其它大分子蛋白質(如BSA、GST、HAS)通過化學劑進行偶聯。例如Aref(2012)利用二甲基甲酰胺(DMF)作為結合劑將純化后的STa與經過修飾的牛血清白蛋白(MBSA)連接，合成了STa-MBSA共軛物蛋白，用此蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得的抗STa血清抗體效價可達到1:1×106。但以上獲得免疫原性STa蛋白的方法均具有不足之處。采用常規的基因融合方法將STa基因與LTB基因或其它的基因進行融合，表達的融合蛋白能夠在不同程度上誘導免疫動物產生針對STa的抗體，但STa基因大小沒有變化，只是將其與某個大分子量蛋白基因連接在一起進行融合表達，融合蛋白中STa蛋白的比例仍然較小，導致該融合蛋白免疫動物后產生針對STa的特異性抗體的效價往往不高。而通過化學方法將STa與其它半抗原蛋白偶聯以獲得免疫原性STa蛋白的方法，首先需要提純STa。STa因為蛋白質分子量小難以進行提純且純化工藝復雜，另外，化學偶聯試劑價格昂貴、無法批量生產，而且這些化學偶聯劑如碳化二亞胺、戊二醛等會造成偶聯蛋白之間的隨機偶聯，甚至會造成STa三級構象的改變，使其抗原表位發生變化，從而影響最終蛋白的免疫效果。為解決上述難題，獲得具有免疫原性的STp蛋白，本專利技術將estp進行4次串聯，構建了estp5-his基因片段，使estp從54bp增加至447bp。將該基因片段插入pGEX-6P-1載體，構建pGEX-6P-estp5-his表達載體。將獲得的表達載體轉入BL21(PlySs)感受態中，表達了融合蛋白STp5-His，大小約為38Ku，理論上使融合蛋白STp5-His的分子量比天然STp增加了5倍，增強了其免疫原性。而且用其免疫動物，能夠刺激小鼠產生抗STp特異性抗體。因此，用此融合蛋白作為免疫原免疫BALB/c鼠，采用細胞融合技術制備了針對融合蛋白STp5-His和天然STp的特異性單克隆抗體，為建立STp血清學檢測技術提供了有效的檢測試劑，解決了用血清學方法檢測STp的難題，且該特異性單克隆抗體能夠體外中和天然STp，具有臨床治療的應用前景。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是克服天然STp不具有免疫原性，無法用其免疫動物制備特異性抗體來建立血清學檢測方法的難題，提供一種新型重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白以及由該重組蛋白免疫動物制備得到的特異性抗體。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白STp5?His，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。

【技術特征摘要】
1.重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白STp5-His，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。2.編碼權利要求1所述的重組豬/牛源大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白STp5-His的核苷酸序列。3.如權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一種含有如權利要求2或3所述核苷酸序列的重組表達載體。5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，通過以下方法構建得到：(1)基因的設計：參照耐熱腸毒素STp成熟肽基因序列，進行大腸桿菌密碼子優化后，設計并合成如下兩段核苷酸序列：estp-linker以及estp-his；其中，estp-linker的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，estp-his的核苷酸序列如SEQIDNO...

【專利技術屬性】
技術研發人員：師東方，韓林林，包軍，董秀梅，朱妍，張萍，劉文鑫，
申請(專利權)人：東北農業大學，
類型：發明
國別省市：黑龍江;23