本發明專利技術屬于生物工程技術領域，具體涉及人參皂苷Rd在制備促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復藥物的應用。提高皮膚表皮祖細胞活性和成纖維細胞活性，促進細胞增殖，促進膠原纖維蛋白分泌，減少基質金屬蛋白酶表達，對于皮膚創傷愈合和損傷組織修復具有十分重要的作用。尋找一種能提高皮膚表皮祖細胞和成纖維細胞活性，促進膠原纖維蛋白分泌，減少基質金屬蛋白酶表達的物質，能有效加快皮膚創傷愈合和損傷組織修復。首先培養皮膚角質祖細胞(KPCs)和人皮膚成纖維細胞(HDFs)，然后試用不同劑量人參皂苷Rd，利用MTT、流式細胞術、RT-PCR和Western?blot等實驗方法，證實人參皂苷Rd處理后KPCs和HDFs細胞活性增強，I-型膠原纖維蛋白分泌增加，MMP1表達減少；有促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復的功能。利用人參皂苷Rd開發為一種促進皮膚創傷愈合和組織修復的新藥。
【技術實現步驟摘要】
人參皂苷Rd在制備促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復藥 物的應用
本專利技術屬于生物工程
，具體涉及人參皂苷Rd在制備促進皮膚創傷愈合 和損傷組織修復藥物的應用。
技術介紹
加快皮膚創傷愈合和損傷組織修復是一個古老的醫學課題，其中，加快皮膚創傷 愈合是外科學研究中的熱點。創傷愈合和組織修復是各種修復細胞增殖、分化、遷移、凋亡 的過程，也是多種細胞因子相互作用的過程。研制促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復的藥 物，對提高組織自我修復能力，縮短創傷愈合時間，增強機體活力有重要意義。 在創傷愈合組織修復過程中，（1)免疫細胞炎癥反應是創傷愈合和組織修復的基 礎。雖然炎癥反應不直接參與創傷愈合和組織修補，但是，它能通過調節多種細胞因子分 泌，增強免疫細胞活性和功能，產生氧自由基和釋放溶酶體，清除壞死組織和異物，防止感 染發生，為創傷愈合修復細胞的活動創造條件。（2)成纖維細胞和細胞外基質對創傷愈合和 組織修復起主要作用。成纖維細胞是構成肉芽組織的主要細胞成分之一，能合成和分泌膠 原、纖維連接蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和透明質酸等多種細胞外基質。細胞外基質對細胞 的形態、細胞的生長和分化有重要調節功能。（3)內皮細胞和新血管為創傷愈合和組織修復 提供保障。內皮細胞是形成毛細血管的主要細胞，為創傷組織提供足夠的氧和營養物質，保 證創傷愈合。內皮細胞還能分泌多種細胞因子，參與創傷組織的修復與調控。（4)角質細胞 活化和上皮再生對創傷愈合和組織修復有重要作用。創傷愈合是由上皮組織中角質形成細 胞的遷移來完成，使暴露的創傷重新被上皮覆蓋，角質形成細胞能通過分泌細胞因子，直接 或間接參與創傷修復與調控。 總之，（1) (3)為創傷愈合和損傷組織修復提供基礎條件，⑵⑷是創傷愈合和損 傷組織修復主體成分，增強皮膚成纖維細胞和皮膚角質祖細胞活性是加速皮膚創傷愈合和 損傷組織修復的關鍵。篩選能促進皮膚成纖維細胞和皮膚角質祖細胞增殖，加快膠原蛋白 分泌的活性成分，對研制促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復藥物十分重要。 文獻報道，人參提取物能提高人皮膚成纖維細胞（HDF)活性，并具有明顯的抗氧 化作用。人參皂苷Rgl衍生物人參皂苷F1能抵抗紫外線誘導的人皮膚角質細胞凋亡。人 參皂苷Rbl能促進皮膚燒傷創面愈合過程中的血管生成。大量實驗證據表明，人參中具有 預防皮膚損傷，促進皮膚再生的活性成分。 我們在人參中尋找到一種增強皮膚成纖維細胞活性，促進膠原蛋白產生，減少膠 原蛋白降解，加快皮膚角質祖細胞分裂，從而促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復的活性成 分。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種人參皂苷Rd，在制備促進皮膚創傷愈合和損傷組織修 復藥物中應用。 實驗結果顯示，增強皮膚成纖維細胞活性，促進膠原蛋白分泌和加快皮膚角質祖 細胞分裂對促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復具有十分重要的作用。人參皂苷Rd能顯著 促進HDFs細胞增殖、遷移、I -型膠原蛋白表達和分泌；促進KPCs活性增強、細胞分裂加 快。 首先在實驗室培養HDFs和KPCs，試用三種不同濃度的人參皂苷Rd細胞培養液處 理HDFs和KPCs，應用MTT和ELISA等實驗方法，觀察到細胞活性均能顯著增強，增殖加快。 應用RT-PCR和Western blot等實驗方法，觀察到I -型膠原蛋白表達分泌增加，MMP1表達 分泌減少。 有益效果：提高機體自我修復能力，加快皮膚創傷愈合，縮短創傷愈合時間，恢復 機體功能。在戰地急救、意外傷害救護和外科手術中有重要意義。人參皂苷Rd能提高HDFs 和KPCs活性。增加 I -型膠原蛋白分泌，抑制MMP1表達。具有提高皮膚創傷愈合和損傷 組織修復的能力，能在制備促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復的藥物中應用。 【附圖說明】 圖1為經Rd處理后，MTT檢測KPCs細胞活性。 圖2為經Rd處理后，MTT檢測HDFs細胞活性。 圖3為經Rd處理后，RT-PCR檢測HDFs細胞I -型膠原mRNA表達水平。 圖4為經Rd處理后，Western blot檢測HDFs細胞I -型膠原蛋白水平。 圖5為經Rd處理后，RT-PCR檢測HDFs細胞MMPlmRNA表達水平。 圖6為經Rd處理后，Western blot檢測HDFs細胞MMP1蛋白水平。 【具體實施方式】 1. KPCs 和 HDFs 細胞培養 分別用6孔培養板在角質細胞生長培養基（KGM2)和10 %胎牛血清DMEM培養基中 接種KPCs (4X104)和HDFs (3X104)兩種細胞。之后更換無血清培養基，過夜。再用不同濃 度人參皂苷Rd分組處理。在KGM2或DMEM完全培養基中37°C、5% C02恒溫培養箱培養24 小時。 2·ΜΤΤ 實驗 經不同濃度人參皂苷Rd分組處理后的KPCs和HDFs，每孔加入ΜΤΤ溶液（5mg/ml)， 所加入MTT溶液約為培養基體積的5%。37°C、5% C02恒溫培養箱培養2小時。離心后棄 上清液，加入二甲基亞砜（DMS0)，搖床低速振蕩，酶聯免疫檢測儀595nm測量各組吸光值。 3. RT-PCR 檢測 經不同濃度人參皂苷Rd分組處理HDFs24小時后，使用Trizol提取細胞中總RNA， 通過測量260nm和280nm處0D值，檢測所提取RNA量以及純度。根據Takara公司提供的 RT-PCR試劑盒說明進行反轉錄和擴增實驗，引物序列如下：1_型膠原上游引物為5' -TAG GGTCTAGACATGTTCAGCTTTGT-3'，下游引物為 5，-GTGAGGGGTGGGATGTCTTCGT-3，；MMP1 上 游引物為 5' -AGATGTGGAGTGCCTGATGT-3'，下游引物為 5' -CTAGGGTACATCAAAGCC-3'; GAPDH 上游引物為 5 ' -CGATATCCCTCCAAAATCAA-3 '，下游引物為 5' -TGTGGTCATGAGTCCTCCCA-3'。選用退火溫度分別為 95°C、54°C和 72°C。使用 1.5%瓊 脂糖凝膠電泳分析PCR產物量。檢測I型膠原和MMP-1各組灰度值。 4. Western blotting 檢測 HDFs細胞接種于6孔培養板，細胞密度2 X105,過夜。無血清培養24小時。用不 同濃度的人參皂甙Rd處理24小時，檢測I型膠原和MMP-1。用細胞被裂解緩沖液I處理 后4°C離心13000rpml5min。收集上清。巴德福特法酶標儀測定樣品中的總蛋白。SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，MMP1 (1:1000)，抗膠原（1:1000)處 理。膜漂洗后二抗孵育，用TBST緩沖液水平搖床漂洗，暗室PVDF膜X光曝光及顯影。 5.結果分析 (1)人參皂苷Rd促進KPCs和HDFs細胞增殖 用三組不同濃度人參皂苷Rd培養皮膚角質祖細胞（KPCs)和人皮膚成纖維細胞 (HDFs) 24小時，均能不同程度提高兩種細胞活性，并有濃度依賴性，人參皂苷Rd高濃度組 促進KPCs和HDFs活性增強程度更加明顯（圖1、圖2)。人參皂苷Rd促本文檔來自技高網...
【技術保護點】
人參皂苷Rd在制備促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復藥物中的應用，其特征是人參皂苷Rd可提高皮膚角質祖細胞和人皮膚成纖維細胞活性，促進增殖，增加I?型膠原纖維蛋白分泌，抑制MMP1表達，從而促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復。
【技術特征摘要】
1.人參皂苷Rd在制備促進皮膚創傷愈合和損傷組織修復藥物中的應用，其特征是人 參皂苷Rd可提高皮膚角質祖細胞和人皮...
【專利技術屬性】
技術研發人員：霍洪亮，李鳳玉，彭雪薇，
申請(專利權)人：東北師范大學，
類型：發明
國別省市：吉林;22
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