miRNA在胎盤組織中的表達制造技術

本發明專利技術提供了用于免疫調節的與在妊娠期間產生免疫耐受性相關的人類miRNA以及其片段、衍生物和變體。所述miRNA可以用于診斷和治療與免疫反應失調相關的病癥、自身免疫病癥、妊娠相關疾病、胎盤形成障礙或問題和由同種異體移植引起的并發癥。另外，描述了用于診斷和治療所述病癥的新的藥物組合物和診斷組合物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】m i RNA在胎盤組織中的表達
本專利技術總體上涉及可用于免疫調節的結合分子，特別是與調節免疫系統相關或可用于調節免疫系統的人類miRNA以及其前體、衍生物、變體和模擬物。另外，本專利技術涉及包含所述結合分子、其前體和模擬物的藥物和診斷組合物，所述組合物不僅在作為診斷工具用于鑒別與妊娠期間母體免疫系統的調節有關的轉錄單元的突變方面，而且在如妊娠相關疾病、胎盤形成障礙或問題、自身免疫疾病等與免疫系統誤調節或過度活躍相關的病癥的治療策略中或在預防或治療移植物對抗宿主的反應方面是有價值的。
技術介紹
為了成功懷孕，必需調節母體的免疫系統。已知胎盤的胚胎/胎兒部分，且確切地說是它的滋養層，能夠產生可以通過與母體免疫系統局部地(即，在蛻膜內以及在外圍)發生相互作用來預防胚胎排斥反應的因子。然而，免疫調節必須在早期妊娠期間就已經有效地發揮作用。在妊娠的前三個月，不少于30%到40%的蛻膜由母體免疫細胞組成，其中大部分(約70%)是NK細胞，但已知巨噬細胞和T細胞也以相當大的百分比存在(Warning等，2011)。 盡管這些介導免疫調節的因子中有一些是已知的，但其它的仍然有待于鑒別。調節母體免疫系統的能力并不限于滋養層，胎兒基質細胞也能夠與母體免疫系統的細胞進行有效的交談(Roelen等，2009)。旨在鑒別負責母體免疫系統的調節的機制的實驗似乎指示可溶性因子以及粒子在這個過程中起重要作用。其中后者是可以由多種細胞類型釋放的外來體，即，小膜囊，且含有由蛋白質、脂質以及mRNA和miRNA組成的多樣性貨物蛋白(cargo)(Valadi等，2007)。在妊娠期間，滋養層的細胞可以分泌似乎會抑制母體免疫系統的外來體(Southcombe等，2011)。然而，不知道這種抑制實際上是如何實現的和其中究竟涉及哪些因子。這些因子的鑒別將為妊娠相關病癥或妊娠期間的并發癥領域內的治療和診斷策略提供新的手段，并且可能也可用于治療若干種與免疫系統失調或過度活躍相關的疾病。 已經通過權利要求書中所描繪的和下文所描述的實施方案解決了這一技術問題。
技術實現思路
本文中所提供的數據令人驚訝地突出了 C19MC miRNA在早期妊娠和胎盤基質細胞中的早期功能。這個數據暗示C19MC以及miR-371-3簇的miRNA是重要的免疫調節劑。已經指定編碼這兩個簇的基因在染色體19的長臂上緊鄰彼此(圖1)。就本文中所提供的數據而言，本專利技術總體上涉及提供用于免疫調節的C19MC以及miR-371-3簇的miRNA、其前體。就此而言，也提供了共有共同種子序列AAGTGC的其它miRNA和能夠干擾這些miRNA分子的靶基因的基因表達的結合分子。此外，本專利技術提供了包含如上文和下文所定義的miRNA分子的核酸序列的核酸、載體和宿主細胞，其中所述核酸序列可操作地連接到調節序列，例如啟動子、增強子，所述調節序列用于誘導和控制本專利技術的上述miRNA分子、其前體或其它結合分子在宿主細胞和/或患者中的表達。就此而言，本專利技術還提供了可用于治療或診斷總體上與免疫系統失調有關聯的病癥(如同在自身免疫疾病、妊娠相關疾病、胎盤形成或植入障礙或問題的情況下)和治療或預防同種異體移植物(植入物)的排斥反應或由于移植物對抗宿主的反應所致的病癥的藥物組合物和診斷組合物。此外，本專利技術還提供了可用于處理被自身免疫疾病侵襲的細胞或者預防或處理例如自身免疫疾病情況下的自體組織破壞現象的藥劑。本專利技術所提供的和上述組合物中所使用的藥劑是被設計用于不同的施用形式，如局部或全身施用。 【附圖說明】 圖1:具有兩個miRNA簇，即C19MC和miR-371-3的染色體區19ql3的圖解 圖2:52個胎盤組織中的miRNA miR-520c_3p的相對表達相對于妊娠周數的關系圖。 圖3:絨膜絨毛的顯微解剖圖。首先從絨膜絨毛(A)切除基質核心(B)，然后切除滋養層(C)。 圖4:以下miRNA在基質和滋養層細胞中的相對表達:miR-371_3p、miR-372、miR-373 和 miR-520c_3p。 圖5:miR-520c-3p和miR-517a_3p在蛻膜和滋養層細胞中的相對表達。 圖6:說明靶向基因轉錄物的miRNA充當Fas-FasL誘導的細胞凋亡的抑制劑的的圖解。已經根據miRBase (18發行版)鑒別了標靶。 圖7:分別在96小時和120小時利用BrdU測定在與JEG-3細胞和bAMC共培養的PBMC中所測量的細胞增殖。 圖8:分別在96小時和120小時利用BrdU測定在處于混合淋巴細胞反應中且用Con A刺激的單獨PBMC中所測量的細胞增殖。 圖9:BC280723的基因組位置。 圖10:miR-517a-3p在經編碼C19MC的BAC載體轉染的牛羊膜源性細胞中在轉染后24小時、48小時和6天時與模擬轉染(mock transfected)細胞相比的相對表達。對于24小時和6天，進行重復轉染。 圖11:(A)miR-520c-3p在!1(:1'-116和邛6-3細胞中的相對表達(關于定量RT-PCR的描述，參見實施例1)。(B)分別經JEG-3細胞和HCT-116細胞的上清液處理的Jurkat細胞中的C-FLIP的相對表達。 【具體實施方式】 miR-371-373 (371-3)簇僅含有7個miRNA，而C19MC是目前已知的最大的人類miRNA簇，總共有大約60種不同的miRNA (表1)。已經報告了 C19MC的成員大量地表達于胎盤的滋養層而不是基質部分中，且在妊娠期間的表達有所增加(Luo等，2009)。關于miR371-373簇在胎盤中的表達，對其細節還是未知。 然而，尚未將兩個簇的miRNA作為可以調節母體免疫系統的候選物加以論述。反對它們與母體免疫調節有關的有力論據來自于現有文獻。首先，C19MC簇成員的表達似乎限于滋養層(Luo等，2009)，但胎盤基質細胞已被描述為也具有免疫抑制功能(Roelen等，2009)。其次，由C19MC簇的miRNA成員的表達增加(Luo等，2009)得出的結論是這些miRNA的功能與妊娠晚期有相當大的關系。 然而，與上文相反，本專利技術內所提供的數據突出了 C19MCmiRNA在早期妊娠和胎盤基質細胞中的早期功能(參見實施例1到4)。就下文更詳細描述的這些實驗結果而言，與此同時提供了 C19MC以及miR-371-3簇的miRNA作為母體免疫系統的重要調節劑。 由于單一 miRNA能夠與超過一個標靶相互作用以及由于miR-371-3和C19MC簇(后者在甚至更大的程度上)中存在多種不同的miRNA，故miRNA的免疫調節功能可能基于多種機制。僅作為一個實例，不希望受理論束縛，實施例8中已經描繪了促細胞凋亡功能，該實施例顯示C19MC簇的成員與拮抗Fas-FasL誘導的細胞凋亡的不同mRNA相互作用。然而，其它相關機制，包括誘導細胞衰老以及可逆細胞周期停滯和無反應性，可能也受miRNA影響。因此，關于這些發現的治療意義，在本專利技術的一個實施方案中，使用本文中所描述的兩個簇的單一 miRNA、每單個簇的miRNA以及其不同的組合來滿足所預期的治療目的。 表1:針對染色體帶本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于免疫調節的miRNA，其中所述miRNA是選自由C19MC簇或miR?371?373簇中所包含的轉錄單元中的任一個所編碼的miRNA。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.11.30 EP 11191362.0;2012.04.05 EP 12163414.1;1.一種用于免疫調節的miRNA，其中所述miRNA是選自由C19MC簇或miR-371_373簇中所包含的轉錄單元中的任一個所編碼的miRNA。2.如權利要求1所述的miRNA，其中所述miRNA是選自:具有SEQID No: 1_66的hsa-miR-498、hsa-miR-512_3p、hsa-miR-512_5p、hsa-miR-515_3p、hsa-miR-515_5p、hsa—miR-516a_3p、 hsa-miR-516a_5p、 hsa—miR-5I6b_3p、 hsa-miR-516b_5p、hsa-miR_5I7_5p、hsa_miR-517a_3p、hsa-miR-5I7b_3p、hsa-miR-517c_3p、hsa—miR-518a_3p、hsa—miR-518a_5p、hsa—miR-518b、hsa—miR-518c_3p、hsa—miR-518c_5p、hsa—miR-518d_3p、 hsa-miR-518d_5p、 hsa—miR-5I8e_3p、 hsa—miR-5I8e_5p、hsa-miR_5I8f_3p、 hsa-miR-5I8f_5p、 hsa-miR-519a_3p、 hsa-miR-519a_5p、hsa-miR-519b-3p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-519d、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-519e-5p、hsa-miR-520a-3p、hsa-miR-520a-5p、hsa-miR-520b、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520c-5p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-520d-5p、hsa-miR-520e、hsa-miR-520f> hsa_miR-520g、 hsa_miR-520h、 hsa-miR-521、 hsa-miR-522_3p、hsa-miR-522_5p、hsa-miR-523_3p、hsa-miR-523~5p> hsa-miR-524_3p、hsa-miR-524_5p、hsa-miR-525_3p、hsa-miR-525_5p、hsa_miR-526a、hsa-miR-526b_3p、hsa-miR-526b_5p、hsa-miR-527、hsa-miR-1283、hsa-miR-1323、hsa-miR-371a_3p、hsa-miR-371a_5p、hsa-miR-371b_3p、hsa-miR-371b_5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373_3p、hsa-miR-373_5p03.如權利要求1或2所述的miRNA，所述miRNA與由C19MC簇或miR-371-373簇所編碼的miRNA具有共同種子序列，其中所述miRNA: a.)是選自:具有SEQ ID No: 67-78 的 hsa-miR-302a_3p、hsa-miR-302a_5p、hsa-miR-302b_3p、 h sa-miR-302b_5p、 hsa-miR-302c-3p> hsa-miR-302c_5p、hsa-miR-302d_3p、hsa-miR-302d_5p ;和 / 或 b.)以一致種子序列AAGTGC為特征。4.一種用于免疫調節的miRNA前體，其包含如權利要求1到3中任一項所述的miRNA的核酸序列。5.一種用于免疫調節的結合分子，所述結合分子能夠干擾如權利要求1到4中任一項所述的miRNA分子的標靶基因的基因表達，其中所述結合分子是選自用于免疫調節的包含合成miRNA模擬物、RNA分子、抗體、適體、鏡像異構體的分子群組。6.一種雙鏈核酸，其包含如權利要求1到4中任一項所述的miRNA或miRNA前體或如權利要求5所述的結合分子的核酸序列。7.—種載體,其包含如權利要求6所述的雙鏈核酸。8.—種宿主細胞，其包含如權利要求7所述的載體。9.如權利要求8所述的宿主細胞，其中所述細胞是人類細胞，優選其中所述細胞是選自患者的自體細胞的群組。10.一種藥物組合物或診斷劑，其包含至少一種根據權利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權利要求4所述的miRNA前體、如權利要求5所述的結合分子、如權利要求6所述的雙鏈核酸、如權利要求7所述的載體和/或如權利要求8或9所述的宿主細胞作為藥劑。11.如權利要求10所述的藥物組合物或診斷劑，其中所述活性劑被包埋在人造外來體中。12.如權利要求1到3中任一項所述的miRNA、如權利要求4所述的miRNA前體、如權利要求5所述的結合分子或如權利要求10或11所述的藥物組合物，其用于治療自身免疫疾病。13.根據權利要求12所述的用途，其中所述自身免疫疾病是選自包括以下的疾病群組:急性播散性腦脊髓炎(ADEM)、斑禿、強直性脊椎炎、抗磷脂綜合征(APS)、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳病、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征(ALPS)、自身免疫性周圍神經病變、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多內分泌腺病綜合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性蕁麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、乳糜瀉、冷凝集素病、克羅恩病、皮膚肌炎、I型糖尿病、子宮內膜異位癥、嗜酸性筋膜炎、胃腸道類天皰瘡、古德帕斯徹氏綜合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利綜合征(GBS)、橋本氏腦病、橋本氏甲狀腺炎、特發性血小板減少性紫癜(自身免疫性血小板減少性紫癜)、紅斑狼瘡、米勒費雪綜合征(格林-巴利綜合征)、混合結締組織病、重癥肌無力、尋常天皰...

【專利技術屬性】
技術研發人員：約恩·布勒尼克，因加·弗洛爾，
申請(專利權)人：不來梅大學，
類型：發明
國別省市：德國;DE