本發明專利技術涉及檢測DNA脫氧核糖核苷酸堿基序列的納米孔DNA測序傳感器。該傳感器包含電流檢測單元，二硫化鉬場效應管，原子力顯微鏡進給系統和陣列單元。將DNA通過化學修飾的方法鍵合在原子力顯微鏡探針上，通過原子力顯微鏡的進給控制系統，可以使得驅動DNA進出納米孔的速度控制在一納米每秒，這一速度完全滿足DNA測序電流信號檢測的帶寬需求。在DNA過孔的過程中，因為納米孔處于二硫化鉬納米帶上，而二硫化鉬納米帶在電流信號的檢測過程中扮演著場效應管的角色，可以對DNA過孔的信號進行實時的放大，有效的提高信噪比。此外通過將原子力顯微鏡探針對應二硫化鉬場效應管陣列化的方法可以同時并行的對待測DNA進行多通道并行實時測序，大大縮短了時間成本。
【技術實現步驟摘要】
一種多通道陣列式DNA測序系統及其測序方法
本專利技術涉及到一種納米孔DNA測序系統及其方法，尤其涉及一種集成原子力顯微 鏡和二硫化鑰場效應管的多通道陣列式DNA測序系統及其測序方法。
技術介紹
納米孔單分子傳感器因其低成本高通量的特點，目前已經被廣泛應用于單分子的 檢測。納米孔單分子傳感器的基本工作原理基于庫特計數器，當帶電單分子在外加電壓條 件下電泳穿過納米孔的時候，因為單分子自身在孔內的物理占位作用以及其與納米孔壁之 間的強相互作用使得過孔的離子電流被調制，通過檢測調制離子電流的幅值和阻塞時間就 可以對單分子的種類及過孔姿態等進行有效檢測。2004年，美國國家衛生研究院提出了 1000美元的基因測序項目，旨在降低基因測序的貨幣和時間成本。納米孔DNA測序技術 因其簡單低成本高通量的特點無疑是最有可能實現這一目標的技術之一。只要納米孔的直 徑小于2納米，薄膜厚度與堿基間的間隙相當，DNA鏈在過孔的過程中便會始終保持單堿 基在孔內占位，不同的堿基會產生對應的離子電流信號，從而實現單堿基辨識的目標。然而 研究者們在不斷推進這一技術的時候仍然面臨著兩個亟待解決的問題。首先，DNA的過孔 速度太快，一般為數微秒每個堿基，而膜片鉗的采樣頻率有限，目前主流的最高采樣頻率為 200 kHz，這將導致單堿基辨識過程中信號嚴重缺失，因此降低DNA的過孔速度十分必要； 其次，DNA過孔信號的信噪比有限，提高信噪比將使得DNA過孔信號的分析更加精確。在納 米孔DNA測序技術發展的過程中，研究者們采取了一系列的措施來降低DNA的過孔速度。 降低驅動電壓，降低體系溫度，增加溶液的粘度，將無機鹽溶液置換成有機鹽溶液，都能適 量降低DNA的過孔速度，然而距離降低到DNA測序所需的速度還很遠；聚合酶對DNA聚合的 速度約為數十毫秒每堿基，因此采用聚合酶驅動DNA可以達到DNA測序的要求，然而聚合酶 驅動DNA操作復雜，而且對環境要求苛刻，這違背了第三代DNA無需修飾，簡單，低成本的初 衷；機械操縱的方法因其能控制DNA過孔的運動方向和過孔速度而成為有效操控DNA過孔 的方法之一，光鑷和磁鑷等DNA操控方法都已經被研究者們提出，然而因光鑷磁鑷等操縱 復雜而且技術尚不成熟，應用于DNA過孔的主動控制還需要很長的時間。因此具有創新意 義和便利性的新型DNA操縱方法亟待被提出。
技術實現思路
(一）要解決的技術問題 本專利技術主要解決的是納米孔DNA測序過程中面臨的主要挑戰：（1)降低DNA的過孔速 度并對DNA過孔實現主動控制；（2)提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比；（3)實現操控 DNA的并行測序，大大縮短DNA測序的時間。 (二）技術方案 為了解決上述技術問題，本專利技術的技術方案是： 一種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應管的多通道陣列式DNA測序技術，其特征 是：包括電流檢測單元，二硫化鑰場效應管，原子力顯微鏡進給系統和陣列單元。所述的電 流檢測單元主要為膜片鉗放大器系統，主要用于檢測二硫化鑰場效應管源漏極間的電流； 所述的二硫化鑰場效應管包括源極電源（匕)，漏極電源（匕)，氮化硅基底，帶有納米孔的二 硫化鑰納米帶和絕緣層；所述的原子力顯微鏡進給系統主要是控制DNA的運動方向和過孔 速度；所述的陣列單元是將上述提到的電流檢測單元，二硫化鑰場效應管及原子力顯微鏡 進給系統進行集成后陣列展開，實現并行操控。 -種集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應管的多通道陣列式DNA測序技術，針對 擬解決的三個技術問題提出了解決方案： (1)本專利技術針對降低DNA的過孔速度并對DNA過孔實現主動控制提出的解決方案： 本專利技術是集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應管的多通道陣列式DNA測序技術，針對 降低DNA的過孔速度并對DNA過孔實現主動控制，提出了采用原子力顯微鏡進給系統對 DNA進行運動方向和過孔速度的主動控制。原子力顯微鏡的進給系統為壓電陶瓷進給，系 統通過設置施加在壓電陶瓷上面的電壓從而轉化為基底的位移，通過其成熟的反饋系統可 以將基底的進給速度控制在1納米每秒，此外原子力顯微鏡進給的方向也能實時的調節切 換，因此可以對DNA過孔實現主動控制。 DNA與原子力顯微鏡探針之間的鍵合可以通過化學修飾的方法實現，首先在原子 力顯微鏡探針的針尖上鍍上一層Cr薄膜涂層（5納米厚)，然后再在涂層上面鍍上一層Au薄 膜（50納米厚)。通過化學方法在單鏈DNA的5'端或3'端修飾上巰基（-HS)，因為巰基與 金之間有強的共價吸附作用，進行簡單的化學處理后就可以將單鏈DNA通過巰基與鍍金的 原子力顯微鏡探針進行有效結合。 (2)本專利技術針對提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比提出的解決方案： 本專利技術是集成原子力顯微鏡和二硫化鑰場效應管的多通道陣列式DNA測序技術，針 對提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比，提出了采用二硫化鑰場效應管對DNA過孔的 信號進行放大，從而大大提高DNA檢測的信噪比。由于單層二硫化鑰的禁帶寬度可以達到 1. 8eV，因此，它是一個理想場效應管材料，其次，單層二硫化鑰的厚度在0. 65nm左右，這樣 的薄膜厚度很適用于納米孔DNA測序。二硫化鑰場效應管的制備過程如下，首先將單層二 硫化鑰納米帶轉移到氮化娃基底上，通過MEMS工藝將二硫化鑰納米帶的兩側與Au (或Pt) 電極相連，覆蓋上絕緣層進行保護后在兩側的電極上分別施加源極和漏極電壓，并在源極 處連接電流檢測裝置，用于實時檢測源漏極之間電流信號的變化。然后在二硫化鑰納米帶 的中間位置用高能透射電子顯微鏡（TEM)將二硫化鑰連同保護層及基底氮化硅打穿，加工 出2納米左右的納米孔。二硫化鑰場效應管的基本工作原理如下，當單鏈DNA穿過二硫化 鑰納米孔的時候，納米孔處的電勢會因為DNA的物理占位作用以及其與二硫化鑰的強相互 作用而發生改變，相當于二硫化鑰場效應管的柵極電壓（匕）發生改變，從而導致由二硫化 鑰納米帶相連的源極和漏極之間的電導發生變化，相比檢測傳統離子電流而言，通過檢測 此時源漏極間的電流變化信噪比將得到大幅度提高。 (3)本專利技術針對實現操控DNA的并行測序提出的解決方案： 通過將（1)中針對降低DNA的過孔速度并對DNA過孔實現主動控制提出的解決方案 和（2)中針對提高DNA過孔過程中信號檢測的信噪比提出的解決方案進行陣列化，即可 以實現DNA操控的并行測序，可以大大縮短DNA測序所需的時間。圖1中給出了陣列化方 案的示意圖，原子力顯微鏡探針的陣列化是通過在原子力顯微鏡探針基底上采用MEMS工 藝制備得到，二硫化鑰納米帶陣列化可以通過將二硫化鑰納米帶轉移到氮化硅基底上按照 所需陣列化圖形排好，這里所需要保證的是原子力顯微鏡探針陣列化后必須與陣列化的二 硫化鑰納米帶上納米孔位置相對應。 上述三個解決方案中，首先采用化學修飾的方法在原子力顯微鏡探針上鍵合待測 單鏈DNA (具體鍵合方法參照下文的【具體實施方式】)，然后通過控制原子力顯微鏡的進給系 統來操縱DNA的過孔遷移速度和方向，以滿足基本的信號檢測帶寬需求。此外提出了采用 二硫化鑰場效應管測序的思路，對DNA過孔信號進行有效放大，提高信噪比。最后將電流檢 測單元，原本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多通道陣列式DNA測序系統，包括電流檢測單元，二硫化鉬場效應管，原子力顯微鏡進給系統和陣列單元；?其中所述二硫化鉬場效應管包括源極電源（Vs）（4）、漏極電源（VD）（9）、氮化硅基底（6）、帶有納米孔的單層二硫化鉬納米帶（7）和絕緣層（8）；所述原子力顯微鏡進給系統包括原子力顯微鏡探針基底（1）和原子力顯微鏡探針（2）；其特征在于：將帶有納米孔的單層二硫化鉬納米帶的兩側分別連接金屬電極作為場效應管的源極和漏極，納米孔作為柵極，其電流信號檢測原理類似于場效應晶體管。
【技術特征摘要】
1. 一種多通道陣列式DNA測序系統，包括電流檢測單元，二硫化鑰場效應管，原子力顯 微鏡進給系統和陣列單元； 其中所述二硫化鑰場效應管包括源極電源（匕）（4)、漏極電源（匕）（9)、氮化硅基底 (6)、帶有納米孔的單層二硫化鑰納米帶（7)和絕緣層（8); 所述原子力顯微鏡進給系統包括原子力顯微鏡探針基底（1)和原子力顯微鏡探針 (2)； 其特征在于： 將帶有納米孔的單層二硫化鑰納米帶的兩側分別連接金屬電極作為場效應管的源極 和漏極，納米孔作為柵極，其電流信號檢測原理類似于場效應晶體管。2. 如權利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統，其特征在于將單層二硫化鑰場效應 管陣列式鋪展在基底上。3. 如權利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統，其特征在于：將納米尺度下二硫化 鑰場效應管應用于DNA過孔時電流變化的實時檢測。4. 如權利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統，其特征在于：通過MEMS工藝在原子 力顯微鏡探針基座上制備出陣列式的探針，并且探針之間的相對位置對應陣列式二硫化鑰 場效應管中的納米孔位置。5. 如權利要求1所述多通道陣列式DNA測序系統，所述電流檢測單元是電流表（3)。6. -種基于權利要求1-5所述多通道陣列式DNA測序系統的測序方法，包括以下步 驟： A、 在氮化硅基底（6)上陣列式鋪展單層二硫化鑰納米帶（7)，將所述納米帶的兩側分 別采用MEMS工藝壓焊上Au或Pt電極，并引出連接源極電源（匕）（4)和漏極電源（匕）（9) 形成各自的獨立電流檢測單元，然后覆蓋...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳云飛，司偉，伍根生，章寅，沙菁潔，劉磊，
申請(專利權)人：東南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。