一種通過胚乳特異性沉默小麥脂肪氧化酶基因表達提高儲藏小麥發芽率和面粉白度的方法技術

本發明專利技術公開了一種通過胚乳特異性沉默小麥脂肪氧化酶基因表達提高儲藏小麥發芽率和面粉白度的方法，所述方法利用RNA干擾(RNAi)技術，特異性抑制脂肪氧化酶(lipoxygenase，LOX)基因在小麥胚乳中的表達，降低LOX在小麥胚乳中的活性。所獲得的LOX-RNAi小麥株系高代材料(T6)轉基因的拷貝數穩定，LOX基因在胚乳表達顯著降低，LOX活性顯著下降。田間實驗表明LOX-RNAi小麥株系重要產量指標與野生型(隴春23)相比無顯著變化。對收獲30天的種子進行發芽實驗，發現3個轉基因株系發芽率與野生型無明顯差異，而磨粉實驗發現轉基因株系面粉白度較野生型顯著提高。經過人工老化，野生型種子發芽率相對轉基因株系顯著降低；同時野生型面粉白度顯著低于轉基因株系。

【技術實現步驟摘要】
一種通過胚乳特異性沉默小麥脂肪氧化酶基因表達提高儲藏小麥發芽率和面粉白度的方法
本專利技術屬于植物基因工程領域。具體地，本專利技術涉及特異性抑制小麥脂肪氧化酶基因在小麥胚乳中的表達的LOX-RNAi表達盒，采用胚乳特異性啟動子組織特異性地抑制LOX表達的載體構建策略，以及培育具有提高的種子耐儲藏性、發芽率和面粉白度的轉基因小麥的方法。
技術介紹
植物種子在自然狀態或者儲藏條件下，隨著時間積累逐漸失去生命力或發芽能力的過程即稱為老化。研究表明，種子萌發所必需的酶類失活或蛋白降解以及由于脂質降解造成細胞膜通透性增加是種子老化的主要原因(Walters，1998)。對于糧食作物，種子老化帶來的影響是多方面的。糧食長時間儲藏會發生陳化變質，造成品質下降和食用性下降，進而造成糧食浪費。在儲藏過程中，種子逐漸衰老，生活力下降，如果用來播種會造成出苗率降低，從而影響農業生產。在國家糧食儲備過程中，糧食的陳化變質一直是影響國家糧食安全儲藏的重要因素之一，每年給國家造成重大的財政損失。據統計，我國糧油初級產品如玉米、水稻、小麥、大豆、花生、油菜等，在儲藏過程中因陳化變質、霉變等因素造成的損失占糧油產量的8-14％。其中僅國家儲備糧的陳化變質，造成的經濟損失就上百億元。因此糧食儲藏在國家安全中扮演著特殊角色，確保我國的糧食儲藏安全是一個重要課題。國際通用的儲藏防陳化方法有：低溫儲藏(自然低溫、機械通風降溫、空調降溫等)；氣控工藝(密閉缺氧、充氮氣、充二氧化碳等)；水控(機械通風降低種子含水量、機器干燥等)；藥物熏蒸。但上述成本投入巨大，占用了國家大量財政支出。目前去除種子陳味的方法有加熱、有機溶劑抽提等，然而加熱處理會導致許多重要蛋白的變性、并且溫度過高會使氨基酸降解，加之這些方法操作復雜、花費較高等原因不適合食品工業的要求。因此對一個發展中國家來說，培育耐儲藏作物具有客觀需求。儲藏種子發生陳化霉變的一個重要原因是植物種子中多鏈不飽和脂肪酸的氧化降解。多鏈不飽和脂肪酸氧化降解可以形成脂肪酸氫過氧化物和自由基，對蛋白質、細胞膜結構、細胞組織及DNA造成損傷，從而使種子失去發芽能力。此外，不飽和脂肪酸氧化降解后產生的一些小分子醛類物質，如倉儲稻米所產生的霉腐氣味物質，及倉儲大豆所產生豆腥味物質，是影響種子品質的關鍵因素之一。催化氧分子與多鏈不飽和脂肪酸反應的首個酶是脂肪氧化酶(EC1.13.11.12，Lipoxygenase，LOX)(Loiseauetal.2001)。LOX是一類不含血紅素鐵，廣泛存在于動物、植物、真菌及微生物中的氧化酶，它存在于植物細胞的微粒、胞質和液泡中，催化不飽和脂肪酸(植物中的天然底物為亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸)形成不穩定的氫過氧化物(hydroperoxides，HPODs)(Kuhnetal.2005；LiavonchankaandFeussner，2006；Schneidereta1.2007；李等，2010)。LOX蛋白是由單條肽鏈組成的，其N端含有一個β-桶結構域，C端含有一個非血紅素鐵的催化中心，鐵與保守的組氨酸及蛋白C端保守異亮氨酸的羧基結合，當鐵為二價時，酶無活性；當鐵被氧化為三價時，酶具有活性。LOX酶與底物的相互識別并結合是由β-桶結構域起作用的(LiavonchankaandFeussner，2006)。根據對亞油酸的氧化位點的選擇，LOX可分為9-LOX和13-LOX。而根據基因序列的差異，可以將LOX分為不含有葉綠體定位肽(type-1)和含有葉綠體定位肽(type-2)兩類(Shibataetal.1994)。前者在氨基酸序列上具有較高的保守性(70％)，而后者的保守性較低(40％)。研究表明LOX在植物多個組織和器官以及植物生長發育的多個時期均有表達(PortaandRocha-Sosa，2002；Baysaland2007)。在植物組織中LOX催化產生的HPOD參與了很多重要信號分子，如脫落酸和茉莉酸的合成(Creelmanetal.1992；StaswickandTiryaki，2004)，因此對植物的生長發育及抵抗各種生物和非生物脅迫均發揮重要作用。如LOX的mRNA表達水平及其催化產物會因機械損傷、病原菌侵襲、昆蟲咬噬、缺水等因素的存在而提高，進一步表明LOX參與植物的多個生理學過程(MoranandIhompson，2001；Vellosilloetal.2007；Sayegh-Alhamdiaetal.2008；Sanieretal.2012；Grebneretal.2013)。在種子中，LOX氧化不飽和脂肪酸可以轉變成令人不愉快的揮發性氣體化合物，導致糧食變質和變味。具體反應機理是：LOX首先將不飽和脂肪酸水解為HPODs，HPODs再經氧化成為多種能產生霉變氣味的揮發性復合物，如己醛，戊醛，戊醇等。此外，LOX反應的產物(過氧羥基衍生物和自由基)對蛋白質、膜結構、細胞組織以及DNA造成破壞，進一步導致儲藏種子活力的喪失，劣變。脂肪氧化酶的缺失或者低活性可以中斷或降低脂質的氧化反應，減輕種子的氧化變質(Suzukietal.1999；Hessleretal.2002)。有研究表明LOX反應產物如己醛、戊醛等揮發性物質在水稻儲藏過程中迅速升高，而LOX-3缺失水稻品系中的己醛、戊醛含量要明顯低于正常的品系(Shinetal.1986；Suzukietal.1999)，水稻LOX-1、LOX-2的缺失也能大大地延緩稻谷陳化氣味的產生(Zhangetal.2005)。通過人工老化和儲藏研究LOX缺失大豆種子特性，發現LOX缺失系種子的發芽率高于正常品系，同時豆腥味下降(王等，2008)。以上研究說明LOX缺失可以延緩植物種子陳化變質。小麥是世界上最重要的糧食作物之一，目前廣泛種植的小麥類型是普通小麥。普通小麥是一種六倍體植物，在世界糧食生產中，我國小麥的產量居世界首位。在小麥研究中發現，LOX與面食制品加工過程中的顏色變化相關，這是因為面粉中的胡蘿卜素和黃色素被LOX氧化降解，導致顏色變暗和營養損失(Bastetal.1996；Leenhardtetal.2006)。在面食制作過程中，LOX導致類胡蘿卜素減少66％、維生素E減少33％，說明LOX對面粉食品的加工和營養品質具有較大的負向效應(Carreraetal.2007)。由于小麥基因組的多倍性，加以LOX基因在植物基因組屬于多基因家族，因此難以通過篩選LOX基因缺失突變體獲得低LOX小麥種質，因此有關LOX和小麥籽粒儲存相關性狀關系研究還比較少。如前所述，脂肪酸代謝途徑參與一些重要生理物質如脫落酸和茉莉酸的合成，LOX組成型缺失同時會造成脂肪酸代謝紊亂，從而影響植物正常生長發育及抵抗各種生物和非生物脅迫。所以應用遺傳學方法培育出LOX缺失品種并不利于現代農業的可持續發展。同時針對小麥基因組的特殊性，我們也難以獲得LOX基因組成性缺失小麥，因此采取基因工程辦法組織特異性的降低LOX表達可能可以達到特異改造小麥籽粒性狀的目的。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術是近年發展的、能夠特異抑制目標基因表達的技術(Ui-Teietal.2004；Horiguchi，2004)。國內本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種特異性抑制小麥脂肪氧化酶基因在小麥胚乳中的表達的LOX?RNAi表達盒，所述表達盒包含：胚乳特異性啟動子，位于胚乳特異性啟動子下游的SEQ?ID?No：1的核苷酸序列、中間序列和SEQ?ID?No：1的反向序列，其中SEQ?ID?No：1、中間序列和SEQ?ID?No：1的反向序列形成發夾結構。

【技術特征摘要】
1.一種特異性抑制小麥脂肪氧化酶基因在小麥胚乳中的表達的LOX-RNAi表達盒，所述表達盒包含：胚乳特異性啟動子，位于胚乳特異性啟動子下游的SEQIDNo：1的核苷酸序列、中間序列和SEQIDNo：1的反向序列，其中SEQIDNo：1、中間序列和SEQIDNo：1的反向序列形成發夾結構。2.根據權利要求1所述的LOX-RNAi表達盒，其中胚乳特異性啟動子的核苷酸序列為SEQIDNo：2。3.根據權利要求1所述的LOX-RNAi表達盒，其中所述中間序列為SEQIDNo：3。4.含有權利要求1-3中任一項所述的LOX-RNAi表達盒的重組表達載體。5.含有權利要求1-3中任一項所述的LOX-RNAi表...

【專利技術屬性】
技術研發人員：董振營，馮波，王濤，劉昕，秦煥菊，王道文，
申請(專利權)人：中國科學院遺傳與發育生物學研究所，中國科學院成都生物研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11