一種CD34+細胞的生產方法技術

本發明專利技術涉及一種CD34+細胞的生產方法。本發明專利技術的方法以臍帶來源的間充質干細胞作為起始材料，在CD34抗體存在條件下經傳代培養，間充質干細胞被誘導成為CD34+細胞。采用本發明專利技術的方法，能夠以相對簡便的方式生產大量CD34+細胞，用于治療肢體動脈狹窄閉塞或糖尿病引起的下肢動脈病變。

【技術實現步驟摘要】
一種CD34+細胞的生產方法
本專利技術涉及細胞生物學領域；更具體而言，涉及一種以臍帶源間充質干細胞為起始材料生產CD34+細胞的方法。
技術介紹
外周動脈病變（peripheralarterialdisease，PAD），尤其是下肢動脈病變往往由動脈硬化閉塞癥和血栓閉塞性脈管炎導致的肢體動脈狹窄閉塞和糖尿病所引起。PAD主要體現為嚴重的肢體缺血，尤其是下肢缺血。目前，臨床上對于遠端流出道通暢者，常以介入支架和外科手術治療。PAD患者常表現為兩種情況：（1）管腔狹窄早期：主要表現為以行走時出現疼痛為特征的間歇性跛行；（2）隨著狹窄的加重，可出現靜息痛，甚至喪失行走能力和伴隨組織壞死與潰瘍發生為特點的危重肢體缺血（criticallimbischaemia,CLI）。CLI的預后極差，5年生存率僅為50%或更低。CLI的治療不僅僅是緩解癥狀、改善受累肢體的功能和防止截肢，還要防止全身動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）的進展，以預防心腦血管事件發生。目前主要的治療手段為：控制高血糖、高血壓、血脂異常；去除危險因素，如吸煙；強制性運動鍛煉；抗血小板藥物和擴血管藥物；以及循環重建手術，如外科手術（如旁路移植術或動脈內膜切除術）、血管內介入技術（如支架置入或球囊擴張術）。經過上述治療后，約40%的CLI患者仍不能改善預后。對于這部分患者來說，截肢目前被認為是挽救生命所做出的最后治療選擇。但截肢后的總死亡率大約為25%-50%；截肢術圍手術期的死亡率為5%-20%；二次截肢率大約為30%。到目前為止，CLI的治療選擇仍然有限，大約40%的患者不符合進行循環重建的指征，或進行循環重建不能得到有益的反應。對于這些“沒有其它治療選擇”的患者，藥物治療對延緩病情進展和預防截肢的作用十分有限。因此，探索缺血肢體血液循環重建的新治療策略對于減少患者截肢和提高患者生活質量具有非常重要的臨床意義。這促使研究者將研究重點轉向尋求具有分化潛能的干細胞移植治療PAD，研究者們希望在病變局部能夠使干細胞被誘導為血管上皮細胞來修復損壞的血管。基礎研究發現，能分化為血管內皮細胞的干細胞類型有血管內皮祖細胞（endothelialprogenitorcell,EPCs）、骨髓源性單核細胞（bonemarrowmononuclearcell,BMMNC）和外周血單核細胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMNC）。但這些干細胞受組織來源的限制，提取和擴增的數量有限。致使這種療法目前尚處于臨床前研究階段。實驗證明，人CD34+細胞（CD34是成熟血管的標志物）可以緩解CLI的癥狀、改善受累肢體的功能和防止截肢。但由于其在臍帶沃爾通氏膠（Wharton'sjelly）中含量僅為5%-10%左右，因此，如何高效地生產該細胞就成為其能否獲得廣泛應用的重要前提。截至目前，對臍帶血中CD34+細胞的分離通常采取Ficoll分離法、羥乙基淀粉分離法和明膠自然沉降分離法，并在隨后用免疫磁珠吸附法（MACS）進一步純化所獲得的CD34+細胞以獲得符合要求的CD34+細胞。上述方法直接從人臍帶血中分離并純化原代CD34+細胞，鑒于人臍帶血的供應量有限，利用上述方法所能獲取的CD34+細胞的數量也極其有限。因此，本領域仍然需要一種能夠以相對簡便的方法從人臍帶生產大量CD34+細胞的方法。
技術實現思路
本專利技術的一方面，提供一種CD34+細胞的生產方法，其包括步驟：（a）提供臍帶來源的間充質干細胞；（b）對間充質干細胞進行原代培養；（c）對間充質干細胞進行傳代培養；（d）在傳代培養過程中，向培養基中加入誘導劑對間充質干細胞進行誘導；（e）獲得CD34+細胞。本領域技術人員理解，可以采用本領域任何適合方式來提供臍帶來源的間充質干細胞。例如，在一些實施方式中，將臍帶組織進行酶解之后得到臍帶來源的間充質干細胞。本領域技術人員理解，可以采用本領域任何適合方式和任何適合的培養基對間充質干細胞進行原代培養。在一些實施方式中，采用貼壁的培養方式對間充質干細胞進行原代培養。在一些實施方式中，在補充有胎牛血清的RPMI1640培養液中對間充質干細胞進行原代培養。經原代培養的間充質干細胞稱為P1代。在本專利技術的上下文中，原代培養是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行的首次培養。在一些實施方式中，可以采用本領域任何適合方式和任何適合的培養基對間充質干細胞進行傳代培養。在一些實施方式中，采用貼壁的培養方式對間充質干細胞進行傳代培養。在一些實施方式中，在補充有人血漿的RPMI1640培養液中對間充質干細胞進行傳代培養。在傳代培養過程中，向培養基中加入誘導劑對間充質干細胞進行誘導。在一個優選的實施方式中，從第5次傳代培養起，向傳代培養基中加入誘導劑將間充質干細胞誘導成CD34+細胞。在一些實施方式中，誘導劑為CD34抗體。CD34抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。CD34抗體可以是鼠源、兔源、豬源、牛源、羊源、馬源、狗源的；優選鼠源、兔源、馬源；最優選鼠源或兔源。在一個優選的實施方式中，CD34抗體是鼠單克隆抗體。在一些實施方式中，CD34抗體在傳代培養基中的終濃度為0.01μmol/L至1μmol/L；優選0.1μmol/L至1μmol/L；最優選0.1μmol/L。與不含CD34抗體的培養條件下，間充質干細胞表達非成熟血管標志物CD105，不表達成熟血管內皮細胞標記物CD34；而在CD34抗體存在條件下，間充質干細胞被誘導表達CD34，成為CD34陽性（+）細胞。在一些實施方式中，自加入誘導劑后，對間充質干細胞傳代培養2至15次；優選5至7次；最優選5次。根據本專利技術的另一方面，提供一種細胞制品，其包括根據本專利技術的方法所生產的CD34+細胞和可藥用載體。本專利技術的細胞制品可以根據本領域常規方法胃腸外施用。目前臨床應用中細胞制品的施用途徑包括但不限于局部注射移植、循環注射移植。根據本專利技術的細胞制品可以制備成任何適合施用的形式。例如制備成適合通過微量泵將含有CD34+細胞的細胞制品泵入目標區域的形式；或者制備成適合通過穿刺針將將含有CD34+細胞的細胞制品注入目標區域的形式。根據移植方式、治療目的的不同，本領域技術人員可以確定自行選擇適當的可藥用載體。在一些實施方式中，可藥用載體是生理鹽水。根據本專利技術的另一方面，提供含有根據本專利技術方法所生產的CD34+細胞的細胞制品在緩解或改善血管病變的藥物中的用途。所述血管病變為肢體動脈狹窄閉塞或糖尿病引起的外周動脈病變（peripheralarterialdisease，PAD）；優選肢體動脈狹窄閉塞或糖尿病引起的下肢動脈病變。附圖說明圖1A.免疫組化結果（CD34蛋白：紅色熒光；CD105蛋白：綠色熒光），無CD34抗體孵育hUC-MSCs，7天的CD105蛋白表達。圖1B.免疫組化結果（CD34蛋白：紅色熒光；CD105蛋白：綠色熒光），0.01μmol/LCD34抗體孵育hUC-MSCs7天的CD105蛋白表達。圖1C.免疫組化結果（CD34蛋白：紅色熒光；CD105蛋白：綠色熒光），0.1μmol/LCD34抗體孵育hUC-MSCs7天的CD105和CD34蛋白表達。圖1D.免疫組化結果本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種CD34+細胞的生產方法，其包括步驟：a）提供臍帶來源的間充質干細胞；b）對間充質干細胞進行原代培養；c）對間充質干細胞進行傳代培養；d）在傳代培養過程中，向傳代培養基中加入誘導劑對間充質干細胞進行誘導；e）獲得CD34+細胞。

【技術特征摘要】
1.一種CD34+細胞的生產方法，其包括步驟：a)提供臍帶來源的間充質干細胞；b)對間充質干細胞進行原代培養；c)對間充質干細胞進行傳代培養；d)在傳代培養過程中，向傳代培養基中加入CD34抗體對間充質干細胞進行誘導；e)獲得CD34+細胞。2.根據權利要求1所述的CD34+細胞的生產方法，其中所述傳代培養基是含人血漿的RPMI1640培養液。3.根據權利要求1所述的CD34+細胞的生產方法，其中所述CD34抗體在傳代培養基中的終濃度為0.01μmol/L至1μmol/L。4.根據權利要求3所述的CD34+細胞的生產方法，其中所述CD34抗體在傳代培養基中的終濃度為0.1μmol/L至1μmol/L。5.根據權利要求4所述的CD34+細胞的生產方法，其中所述CD34抗體在傳代培養基中的終濃度為0.1μmol/L。6.根據權利要求1所述的CD34+細胞的生產方法，其中所述CD34抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。7.根據權利要求6所述的CD34+細胞的生產方法，其中所述CD34抗體是鼠源、兔源、豬源、牛源、羊源、馬源或狗源的。8.根據權利要求1所述的CD34+細胞的生產方法，自加入CD34抗體后，對間充質干細胞傳代...

【專利技術屬性】
技術研發人員：唐立峰，
申請(專利權)人：吉林省拓華生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：吉林;22