一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動物的方法及應用技術

本發明專利技術涉及制作基因敲除動物模型的領域，具體講，涉及一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動物的方法及應用。其制備方法為：從基因組DNA中分離iGb3S基因，經長鏈PCR方法擴增獲得同源臂，與抗生素耐藥基因復合構建打靶載體；將打靶載體轉入到胚胎細胞，將重組胚胎細胞注入代孕動物胚胎中，移植到假孕動物體內，與正常動物交配；對得到的嵌合體動物進行基因型驗證，篩選基因成功敲除的陽性基因敲除的嵌合體動物；進一步與野生型動物交配，獲得F1代雜合子；F1代雜合子之間交配后獲得兩條染色體均被剔出的純合子動物，建系獲得基因敲除動物種群。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術涉及制作基因敲除動物模型的領域，具體講，涉及一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動物的方法及應用。其制備方法為：從基因組DNA中分離iGb3S基因，經長鏈PCR方法擴增獲得同源臂，與抗生素耐藥基因復合構建打靶載體；將打靶載體轉入到胚胎細胞，將重組胚胎細胞注入代孕動物胚胎中，移植到假孕動物體內，與正常動物交配；對得到的嵌合體動物進行基因型驗證，篩選基因成功敲除的陽性基因敲除的嵌合體動物；進一步與野生型動物交配，獲得F1代雜合子；F1代雜合子之間交配后獲得兩條染色體均被剔出的純合子動物，建系獲得基因敲除動物種群。【專利說明】一種制備iGb3S基因敲除的非人晡乳動物的方法及應用
本專利技術涉及制作基因敲除動物模型的領域，具體講，涉及一種制備iGb3S基因敲 除的非人哺乳動物的方法及應用。
技術介紹
由哺乳動物細胞外基質構成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被廣泛 用于外科的創傷修復、組織重建和組織工程的支架材料等。異種器官也早已成為解決器官 移植中供器官嚴重缺乏的潛在途徑之一。然而，動物源性生物材料或異種器官組織應用于 人體所帶來的免疫學問題直接影響著這類材料使用的安全性和有效性。異種器官移植的最 大障礙是供器官異種抗原與受者體內天然抗體結合后激活補體系統，攻擊供器官而產生的 超急性免疫排斥反應（Hyperacute rejection，HAR)，其發生時間在異種移植后的幾分鐘至 數小時，供器官在短時間內發生功能衰竭使移植失敗。動物源性生物材料雖經各種去除抗 原的處理，卻難以徹底去除所有的異種抗原，殘留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反應和免 疫毒性而影響創傷愈合的重要因素。 已有研究顯示異種抗原α -半乳糖基抗原（α -1，3-galactosyle，a -Gal)是動物 源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚乳 糖胺核心末端殘基的細胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，廣泛存在于豬和其它低等動物體內。 a -Gal 主要受：α -1，3 半乳糖基轉移酶（α 1，3-galactosyltransferase，α -1，3GT)及異 紅細胞糖苷酯合成酶（isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside 3 synthase， iGb3S)調控。由于人體及類人猿、舊世紀猴的半乳糖苷轉移酶基因有2個堿基錯位變異而 不表達Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗a -Gal抗體（占總血清球蛋白的1% )，因此 當人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時會導致超急性免疫排斥反應及慢 性的免疫毒性反應。有研究證實人血清中的抗a -Gal抗體既與α -1，3GT催化的Gal抗 原（糖蛋白）反應，也與iGb3S催化的Gal抗原（糖脂肪）反應。動物源性生物材料或異 種器官移植中Gal抗原的去除成為降低免疫排斥和慢性免疫毒性反應的關鍵。目前，如何 評價Gal抗原的去除和殘留Gal抗原誘導的免疫毒性尚存在著瓶頸。由于野生型低等動物 都表達a-Gal抗原，因此無法利用野生型低等動物去評價a-Gal抗原相關的免疫毒性反 應，只能用狒狒作為受體來考察a -Gal抗原陽性或者異體器官的免疫毒性反應，而這種動 物稀少很難普及使用。因此，如何評價動物源性生物材料或異種器官組織的免疫毒性存在 著瓶頸。檢測與監管機構因沒有方法和標準可依據而無法進行有效的安全性和質量監控， 同時也限制了該類產品的研發和產業化發展。 國際上早在90年代就有通過構建a-l，3GT基因敲除小鼠，來研究a-Gal相關的 免疫學反應，探討不含Gal抗原的克隆動物的構建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle 等報告了 a-l，3GT基因敲除小鼠模型的成功制作方法，為a_l，3GT基因敲除克隆豬的 構建開辟了先鋒。之后開始有報告使用a-1，3GT基因敲除小鼠模型研究其與人所誘導抗 體的相似性及其免疫學特征。Chiang TR等報告，a-l，3GT基因敲出小鼠免疫后誘導的 抗-Gal抗體與a -Gal結合的親和性和人的抗Gal抗體相似，是能夠誘導Gal抗原陽性異 種心臟補片的超急性免疫排斥反應。Chong A等報告，a_l，3GT基因敲除小鼠能夠誘導自 然的抗a -Gal IgM和IgG，并呈現周齡依存性增強；在同種異體或異種補片移植后可以觀 察到T-cell依存性的抗a -Gal抗體反應。這些研究提示α -1，3GT基因敲除小鼠模型對 Gal抗原殘留誘導的免疫毒性具有敏感的反應性。 a -Gal抗原引起的超急性免疫排斥反應和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入 研究。許多實驗室采用了不同的方法對供器官或細胞進行處理，其中以酶處理法、物理化學 分離法及交聯法和基因改造等方法的研究最廣泛。在2000年初研究者們開始了 a_l，3GT 基因敲除豬的研究，甚至a-l，3GT基因敲除牛的研究，期望能夠直接從a_l，3GT基因敲除 豬或牛獲得沒有Gal抗原的組織或器官，以避免動物源性生物材料及異種臟器移植的免疫 排斥反應。Dai Y及Lai L等報道，他們運用核轉移技術成功培育出了 a_l，3GT基因敲除 豬（GT/KO pig)。實驗研究顯示a-l，3GT基因敲除豬來源的生物材料能夠顯著減輕Gal抗 原誘導的超急性排斥反應。 國內關于a-l，3GT基因敲除動物模型的研究也已起步，但進展緩慢，大部分研究 都還停留在打靶載體構建或胚胎細胞重組的階段。關于iGb3S基因敲除動物的研究未見報 道。第三軍醫大學的張偉在博士論文中曾記述了 C57BL/6J小鼠胚胎干細胞的a-l，3GT基 因敲除的工作，成功獲得了 a-1，3GT基因敲除的小鼠胚胎干細胞。作者周建在林愛星導師 的指導下曾進行了"豬體細胞a -1，3-半乳糖基轉移酶基因的敲除并敲入HLA-G1基因的 研究"，獲得敲除a _1，3GT并敲入HLA-G1基因的體細胞。在2011年，南方醫科大學的鄭道 山碩士研究生開展了 "利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1 ( a -1，3GT)基 因"的研究。軍事醫學科學院野戰輸血研究所的作者常宏宇報道了利用正負篩選打靶載體 在豬腎細胞系PK-15細胞中敲除GGTA1基因，獲得了雜合子GGTA1 (+/-)PK-15細胞。戴一 凡教授早在2002年在美國留學期間就在國際上率先發表了 a _1，3GT基因敲除豬的研究成 果。據報道戴一凡教授于2011年回到南京醫科大學代謝疾病研究中心，率領團隊開始了 a -1，3GT基因敲除豬的深入研究和育種繁殖，并很快成功迎來了首批轉基因克隆豬的誕 生。 有研究發現，a _1，3GT基因敲除的小鼠或者豬仍然表達a-Gal抗原，仍然能夠 觀察到輕度的免疫排斥反應。另外有研究已經證實人的組織器官中不表達活性的iGb3， 提示由iGb3S轉移酶基因轉寫的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是動物源性材料移植于人 體時造成異種免疫排斥反應的另一種外源性抗原。Milland等的研究顯示在a-l，3GT基 因敲除動物體內仍然表達低水平但有顯著意義的Gal抗原。a -1，3GT基因敲除小鼠表達 iGb3S mRNA本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備iGb3S基因敲除的非人哺乳動物的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)構建打靶載體：從基因組DNA中分離iGb3S基因，經長鏈PCR方法擴增獲得同源臂，與抗生素耐藥基因復合構建打靶載體；(2)將打靶載體轉入到胚胎細胞，將重組胚胎細胞注入代孕動物胚胎中，移植到假孕動物體內，與正常動物交配；(3)對得到的嵌合體動物進行基因型驗證，篩選基因成功敲除的陽性基因敲除的嵌合體動物；進一步與野生型動物交配，獲得F1代雜合子；F1代雜合子之間交配后獲得兩條染色體均被剔出的純合子動物，建系獲得基因敲除動物種群。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐麗明，邵安良，范昌發，單永強，陸艷，章娜，楊昭鵬，林永亮，徐斌，
申請(專利權)人：中國食品藥品檢定研究院，
類型：發明
國別省市：北京;11