用于鑒定培養物中微生物的光譜手段和方法技術

公開了用于光譜檢測和鑒定培養物中細菌的光譜方法。所述方法整合了從懷疑含有所述細菌之經培養樣品構建至少一個數據集，其可為光譜、干涉圖樣或散射圖樣。針對所述樣品中水的存在，對所述數據集進行校正，使用主成分分析提取光譜特征，并使用學習算法對所述特征分類。在本發明專利技術的一些實施方案中，例如為將MRSA與MSSA區別，進行多模態分析，其中細菌的鑒定是基于樣品的光譜、用來確定細胞壁厚度的干涉圖樣以及用來確定細胞壁粗糙度的散射圖樣進行的。還公開了用于進行所述方法的設備，所述設備的一個實施方案整合了多樣品分析儀。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于鑒定培養物中微生物的光譜手段和方法相關申請引用本申請要求于2011年12月19日提交的US臨時專利申請號61/577,131的優先權，其通過引用被整體并入本文。
本專利技術涉及用于鑒定培養物中微生物的光譜(spectroscopic)手段(means)和方法。特別地，本專利技術涉及用于鑒定培養物中微生物的手段和方法，其依賴于整個細胞的光譜測量，而非細胞特定的化學組成，以及涉及整合其他基于光之測量方法(例如干涉分析法)的手段和方法。
技術介紹
微生物的鑒定，特別是抗生素抗性細菌的檢測，在醫藥領域中是極其重要的。眾所周知，衛生保健機構投入了大量的努力來防止患者受到由環境細菌且特別是由于那些抗生素抗性細菌所引起之二次疾病的感染。通常用來區分抗生素抗性細菌和抗生素敏感性細菌的方法是直接對樣品使用PCR或在培養樣品后使用PCR。這樣的方法公開在例如US專利號4,683,202中。另一種方法是通過檢測蛋白質組，即通過基因組表達的不同蛋白質。通過常見細菌性病原體的檢測用于通用細菌檢測的基于DNA的方法也是本領域已知的，例如，如美國專利申請公開號2005/0042606中公開的。在PCT公開號WO90/04041中已經公開了通過將從樣品獲得的細菌培養物暴露于具有已知宿主范圍的轉導顆粒檢測有活力的細菌。這些方法的問題在于它們一般花費顯著量的時間(通常至少一小時)來產生結果，且僅可由合格的專業技術人員進行。解決這些問題的一個可能途徑可為光譜技術的使用，其本質上比這些方法快。一些用于鑒定細菌而不對抗生素抗性菌株特異的光譜方法在本領域中是已經的。例如，PCT公開號WO98/41842公開了通過拉曼光譜法(Ramanspectroscopy)來檢測細菌抗體復合物的系統。將用于測試細菌存在的樣品放置于培養基中，所述培養基含有連接到一表面的抗體，所述抗體用于結合至特定細菌以形成抗原-抗體復合物。類似地，共振拉曼反散射作為鑒定細菌的方法在U.S.專利公開號4,847,198中公開。在這些方法中，將與特定細菌相關之標記物在拉曼光譜中的存在作為細菌存在的指示。U.S.專利號6,379,920公開了用于檢測和鑒定生物樣品中特定細菌的光譜方法，對于其所要求保護的來說，培養是不必需的。所述方法包括從未感染的患者獲得生物樣品的光譜作為參考，將所述參考從可能感染的樣品光譜減去，并將產生的差異光譜的指紋區與已知細菌的參考光譜進行比較。Naumann等(EncyclopediaofAnalyticalChemistry，R.A.Meyers(編)102-131頁，JohnWiley&SonsLtd，Chichester，2000)已經報道了在干燥的樣品中用于鑒定和分類細菌的FTIR光譜的用途。通過使用FTIR和近紅外FT-拉曼光譜，已經鑒定了活微生物。其他方法包括使用熒光光譜法或以上光譜技術的組合。現有技術文獻均未公開可以快速(少于1小時)且不需要專業技術人員檢測并且區分抗生素抗性細菌和抗生素敏感性細菌的手段和方法。而且，現有技術文獻均未公開可以排除樣品中所含的水對實驗信號的干擾從而提供更靈敏和更準確的一般細菌和特定抗生素抗性細菌之檢測的手段和方法。因此，對于迅速、靈敏并準確地從原代培養板樣品檢測和鑒定微生物，而不使用另外的試劑或復雜的樣品制備之手段和方法，特別是可以將抗生素敏感性細菌和抗生素抗性細菌區分的手段和方法，存在長期的需要。
技術實現思路
本文公開的專利技術設計為滿足該長期需要。本專利技術公開了用于光譜鑒定培養物中微生物的方法和系統。特別地，本文公開的方法包括將因水產生的光譜中的偽差(artifact)移除的步驟，使用主成分分析(PrincipalComponentsAnalysis)來提取目的光譜特征，并使用學習算法(learningalgorithm)(例如RANDOMFOREST分類器方法)來將光譜特征圖(signature)分類。所述方法還整合了通過使用多模態(multimodal)技術區分抗生素抗性細菌(例如甲氧西林抗性金色鏈球菌(StreptococcusStreptococcusaureus)(MRSA))與抗生素敏感性細菌(例如甲氧西林敏感性金色鏈球菌(MSSA))的步驟，所述多模態技術將確定樣品中細菌的至少一種化學特征的光譜法以及(suspuses)確定細菌細胞壁厚度的干涉分析法組合。因此，本專利技術的目的在于公開用于光譜檢測和鑒定培養物中微生物的方法，其中所述方法包括：1.獲得懷疑含有所述微生物的至少一個經培養樣品；將所述經培養樣品轉移至樣品池(cell)；將所述樣品與從光源獲得的光相互作用；在所述相互作用的步驟之后，測量至少一部分剩余的所述光；由所述經測量的光構建至少一個數據集，其中所述數據集包含至少一種類型選自以下的數據集：吸收光譜、反射光譜、熒光光譜、散射圖樣和干涉圖樣；2.如果所述數據集為光譜：則通過進行至少一個選自以下的步驟預處理所述數據集：(a)針對因水在所述經培養樣品中的存在產生的信號，對所述數據集進行校正，(b)移除基線，(c)降噪，以及(d)提取目的光譜區，從而產生經校正的數據集；通過使用主成分分析(PCA)方法從所述經校正的數據集提取目的光譜特征，且指定從所述主成分分析獲得的最大本征值或成分作為特征，從而產生一組經提取的光譜特征，并通過使用整合了學習算法的方法將所述經提取的光譜特征分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中；3.如果所述數據集為干涉圖樣：則從所述干涉圖樣估計所述微生物的細胞壁厚度；并將所述細胞壁厚度分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中；4.如果所述數據集為散射圖樣：則從所述散射圖樣估計所述微生物的細胞壁粗糙度；并將所述細胞壁粗糙度分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中。本專利技術的另一個目的在于公開這樣的方法，其中所述獲得經培養樣品的步驟包括：獲得生物樣品；培養所述生物樣品，從而產生經培養樣品；以及將所述菌落(colony)涂抹在表面上。在本專利技術一些優選的實施方案中，培養的步驟之后進行選擇多個菌落的步驟。在本專利技術一些優選的實施方案中，所述生物樣品為選自于固體形式和液體形式的形式。在本專利技術一些優選的實施方案中，所述生物樣品選自噴嚏、唾液、粘液、膽汁、尿、陰道分泌物、中耳抽出物(middleearaspirate)、膿、胸腔積液、滑液、膿腫、腔拭子(cavityswab)、血清、血液和脊液。在本專利技術一些優選的實施方案中，所述培養所述生物樣品的步驟包括將包含在樣品中的所述生物樣品在瓊脂板中培養12至24小時。在本專利技術一些優選的實施方案中，所述涂抹的步驟包括在表面上涂抹以覆蓋2.5cm直徑的區域。在本專利技術一些優選的實施方案中，所述涂抹的步驟包括在鏡子的反射表面上涂抹。在本專利技術一些優選的實施方案中，其中所述反射表面為金。本專利技術的另一個目的在于公開如上任何所定義的方法，其中所述將所述經培養樣品轉移至樣品池的步驟包括將所述經培養樣品轉移至多次傳遞池(multiplepasscell)。本專利技術的另一個目的在于公開如上任何所定義的方法，其中所述獲得至少一個經培養樣品的步驟包括獲得多個經培養樣品；所述將所述經培養樣品轉移至樣品池的步驟包括將所述多個經培養樣品的每個轉移至樣品本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于光譜檢測和鑒定培養物中微生物的方法，其中所述方法包括：獲得懷疑含有所述微生物的至少一個經培養樣品；將所述經培養樣品轉移至樣品池；將所述樣品與從光源獲得的光相互作用；在所述相互作用的步驟之后，測量至少一部分剩余的所述光；如果所述數據集為光譜：則通過進行至少一個選自以下的步驟預處理所述數據集：(a)針對因所述經培養樣品中水的存在產生的信號，對所述數據集進行校正，(b)移除基線，(c)降噪，以及(d)提取目的光譜區，從而產生經校正的數據集；通過使用選自主成分分析(PCA)和線性預測編碼的方法從所述經校正的數據集提取目的光譜特征，從而產生一組經提取的光譜特征；通過使用整合了學習算法的方法將所述經提取的光譜特征分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中；且通過使用特征選擇方法發現最優的一組特征；如果所述數據集為干涉圖樣：則從所述干涉圖樣估計所述微生物的細胞壁厚度；且將所述細胞壁厚度分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中；如果所述數據集為散射圖樣：則從所述散射圖樣估計所述微生物的細胞壁粗糙度；且將所述細胞壁粗糙度分類，從而確定所述細菌是否存在于所述經培養樣品中。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.12.19 US 61/577,1311.一種用于光譜檢測和鑒定培養物中微生物的方法，其中所述方法包括：獲得懷疑含有所述微生物的至少一個經培養樣品；將所述經培養樣品轉移至樣品池；將所述樣品與從光源獲得的光相互作用；在所述相互作用的步驟之后，測量至少一部分剩余的所述光；由經測量的所述光構建至少一個數據集；如果所述數據集為光譜：則通過進行至少一個選自以下的步驟預處理所述數據集：(a)針對因所述經培養樣品中水的存在產生的信號，對所述數據集進行校正，(b)移除基線，(c)降噪，以及(d)提取目的光譜區，從而產生經校正的數據集；通過使用選自主成分分析(PCA)和線性預測編碼的方法從所述經校正的數據集提取目的光譜特征，從而產生一組經提取的光譜特征；通過使用整合了學習算法的方法將所述經提取的光譜特征分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中；且通過使用特征選擇方法發現最優的一組特征；如果所述數據集為干涉圖樣：則從所述干涉圖樣估計所述微生物的細胞壁厚度；且將所述細胞壁厚度分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中；如果所述數據集為散射圖樣：則從所述散射圖樣估計所述微生物的細胞壁粗糙度；且將所述細胞壁粗糙度分類，從而確定所述微生物是否存在于所述經培養樣品中，其中所述獲得懷疑含有所述微生物的至少一個經培養樣品的步驟包括獲得多個經培養樣品；所述將所述經培養樣品轉移至樣品池的步驟包括將所述多個經培養樣品的每個轉移至樣品池，所述樣品池被布置在多室分析儀之分開的室中；且所述構建至少一個數據集的步驟包括對所述多個樣品的每個分別構建數據集，其中所述多室分析儀的每個室包含：入射孔；與所述入射孔對齊的出射孔；池；以及可在第一位置和第二位置之間活動之可活動的回轉鏡，在所述第一位置中通過所述入射孔進入所述室的光從所述鏡反射入所述池，在所述第二位置中通過所述入射孔進入所述室的光傳到所述出射孔而不進入所述池。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述獲得懷疑含有所述微生物的至少一個經培養樣品的步驟包括：獲得生物樣品；培養所述生物樣品，從而產生經培養樣品；以及將菌落涂抹在表面上。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述生物樣品為選自于固體形式和液體形式的形式。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述生物樣品選自噴嚏、唾液、膽汁、尿、陰道分泌物、中耳抽出物、膿、胸腔積液、滑液、腔拭子、血清、血液和脊液。5.根據權利要求2所述的方法，其中所述生物樣品選自粘液和膿腫。6.根據權利要求2所述的方法，其中培養所述生物樣品的步驟包括將包含在樣品中的所述生物樣品在血瓊脂板中培養12至24小時。7.根據權利要求2所述的方法，其中所述涂抹的步驟包括在表面上涂抹以覆蓋2.5cm直徑的區域。8.根據權利要求2所述的方法，其中所述涂抹的步驟包括在鏡子的反射表面上涂抹。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述反射表面為金。10.根據權利要求2所述的方法，其中所述培養的步驟之后進行選擇多個菌落的步驟。11.根據權利要求1所述的方法，其中所述將所述經培養樣品轉移至樣品池的步驟包括將所述經培養樣品轉移至多次傳遞池。12.根據權利要求1所述的方法，其中所述池為多次傳遞池。13.根據權利要求11或12之一所述的方法，其中所述多次傳遞池包含：拋物柱面鏡；光會聚構件，其用于會聚所述光源的輸出，并被布置為使得所述光源的輸出射到所述拋物柱面鏡；光耦合構件，其用于將來自多次傳遞池的光指引至檢測器；包含樣品保持構件的臺，所述樣品保持構件用于保持樣品，布置所述臺以使得至少一部分從所述光源經由所述光會聚構件傳到所述拋物柱面鏡，然后從所述拋物柱面鏡反射的光，將射到經由所述樣品保持構件連接到所述臺的樣品，并使得從所述樣品反射至所述拋物柱面鏡的光將被指引至非所述樣品的位置；且布置n個折疊鏡使得：從所述樣品反射至所述拋物柱面鏡的光將射到所述折疊鏡之一；對于m＝1至n-1，射到第m個折疊鏡的光將被反射回至所述拋物柱面鏡，使得其將隨后被反射到所述樣品上，且使得從所述樣品反射的光將從所述拋物柱面鏡反射至第m+1個折疊鏡；而對于m＝n，從所述第m個折疊鏡反射的光將被指引至所述光耦合構件。14.根據權利要求13所述的方法，其中圍繞圓周成對布置所述n個折疊鏡。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述n個折疊鏡包含7對鏡子。16.根據權利要求1所述的方法，其中所述光源包括FTIR光譜儀的光源。17.根據權利要求1所述的方法，其中所述光源包括拉曼光譜儀的光源。18.根據權利要求1所述的方法，其中所述光源為激光器。19.根據權利要求18所述的方法，其中所述激光器選自二極管激光器和量子級聯激光器。20.根據權利要求1所述的方法，其中所述構建至少一個數據集的步驟包括構建選自以下的光譜：紅外吸收光譜、紅外反射光譜、拉曼光譜、UV-VIS吸收光譜和UV-VIS反射光譜。21.根據權利要求20所述的方法，其中所述構建至少一個數據集的步驟包括構建紅外吸收光譜。22.根據權利要求21所述的方法，其中所述預處理的步驟包括提取選自以下的光譜范圍：850-1000cm-1；990-1190cm-1；1180-1290cm-1；1235-1363cm-1；1300-1350cm-1；1500-1800cm-1；1550-1650cm-1；1720-1780cm-1；2800-3050cm-1；2836-2995cm-1；和3000-3300cm-1。23.根據權利要求1所述的方法，其中針對因水在所述經培養樣品中的存在產生的數據的存在，對所述數據集進行校正的步驟包括選自以下的步驟：(a)通過從所述數據集減去由其他數據集的平均值所構建的數據集來進行簡單濾波；(b)從所述數據集減去參考數據集；以及(c)通過使用參考信號的自適應濾波進行自適應濾波以產生將水信號對所測量的樣品光譜之作用的最優降低。24.根據權利要求1所述的方法，其中所述預處理所述數據的步驟包括通過使用選自以下的至少一種技術降噪：線性濾波、自適應濾波、使用Savitzky-Golay濾波器、低通濾波和譜減法。25.根據權利要求1所述的方法，其中所述使用主成分分析(PCA)方法的步驟包括：獲得所述數據集的一階和二階導數；且獲得所得到之每個導數的兩個系數。26.根據權利要求1所述的方法，其中所述經提取的光譜特征組包括選自以下的光譜特征：峰相關性、峰波長、峰高、峰寬、峰截面、峰面積、經擬合多項式曲線的至少一個系數、在信號的至少兩個峰下的面積總和，線性預測編碼(LPC)、信號的平均值、信號的方差值、偏度值、峰度值、參數的高斯集(μ，σ，Ai)、峰強度比、小波系數及其衍生。27.根據權利要求1所述的方法，其中所述特征選擇方法選自順序特征選擇和遺傳算法。28.根據權利要求1所述的方法，其中所述學習算法選自貝葉斯分類器、支持向量機(SVM)、線性判別函數、Fisher線性判別、C4.5算法樹、K最近鄰法、加權K最近鄰法、分級聚類算法、整合了使用由Breiman和Cutler開發的方法之集成分類器的學習算法、隱馬爾科夫模型、高斯混合模型(GMM)、K均值聚類算法、Ward聚類算法、最小二乘法和神經網絡算法。29.根據權利要求28所述的方法，其中所述學習算法整合了使用由Breiman和Cutler開發之方法的集成分類器。30.根據權利要求1所述的方法，其中所述分類的步驟是基于通過所述學習算法獲得的擬合的參數而進行的，所述學習算法基于具有最小顯著性閾值的特征。31.根據權利要求30所述的方法，其中所述最小顯著性閾值為95％置信界限。32.根據權利要求30所述的方法，其中通過選自χ2、Wilcoxon檢驗和學生t檢驗的統計檢驗確定所述最小顯著性閾值。33.根據權利要求1所述的方法，其中所述微生物包括選自以下的細菌：葡萄球菌(Staphylococcus)；鏈球菌屬(Streptococcusspp.)；腸球菌屬(Enterococcusspp.)；棒桿菌屬(Corynebacteriumspp.)，氣球菌屬(Aerococcusspp.)；微球菌屬(Micrococcusspp.)；消化鏈球菌屬(Peptostreptococcusspp.)；乳球菌屬(Lactococcusspp.)；明串珠菌屬(Leuconostocspp.)；Tothiaspp.；孿生球菌屬(Gemellaspp.)；產堿菌屬(Alcaligenesspp.)；鏈格孢菌屬(Alternariaspp.)；黃桿菌屬(Flavobacteriumspp.)；芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)；無色桿菌屬(Achromobacterspp.)；不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)；放線桿菌屬(Acinobacillusspp.)；彎曲桿菌屬(Campylobacterspp.)；愛德華氏菌屬(Edwardsiellaspp.)；埃里希氏體屬(Ehrlichiaspp.)；腸桿菌屬(Enterobacterspp.)；愛文氏菌屬(Ewingellaspp.)；黃桿菌門(Flavobateria)；哈夫尼菌屬(Hafniaspp.)；克雷伯氏菌屬(Klebsiellaspp.)；克呂沃爾氏菌屬(Kluyveraspp.)；軍團菌屬(Legionellaspp.)；莫拉氏菌屬(Moraxellaspp.)；摩根氏菌屬(Morganellaspp.)；奈瑟氏球菌屬(Neisseriaspp.)；巴斯德氏菌屬(Pasteurellaspp.)；普雷沃氏菌屬(Prevotellaspp.)；變形菌屬(Proteusspp.)；普羅威登斯菌屬(Providenciaspp)；假單胞菌屬(Pseusomonasspp.)；拉恩氏菌屬(Rahnellaspp.)；沙門氏菌屬(Salmonellaspp.)；沙雷氏菌屬(Serratiaspp.)；志賀氏菌屬(Shigellaspp.)；鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacteriumspp.)；弧菌屬(Vibriospp.)；耶爾森氏菌屬(Yershiniaspp.)；奈瑟氏球菌屬(Neisseriaspp.)；金氏菌屬(Kingellaspp.)；心桿菌屬(Cardiobacterium)；非結核分枝桿菌(NTB)，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)；和鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)。34.根據權利要求1所述的方法，其中所述微生物包括選自以下的細菌：凝固酶陰性葡萄球菌；金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)和綠色鏈球菌(Streptococcusviridans)群。35.根據權利要求1所述的方法，其中所述微生物包括選自以下的細菌：金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)；表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)；溶血葡萄球菌(Staph.haemolyticus)；路鄧葡萄球菌(Staph.lugdunensis)；中間葡萄球菌(Staph.intermedius)；人葡萄球菌(Staph.hominis)；模仿葡萄球菌(Staph.simulans)；沃氏葡萄球菌(Staph.warneri)；解糖葡萄球菌(Staph.saccharolyticus)；頭狀葡萄球菌(Staph.Capitis)；所有其他的凝固酶陰性葡萄球菌(Staphylococcus)；釀膿鏈球菌(Strep.pyogenes)群A；無乳鏈球菌(Str.agalactiae)群B；鏈球菌(Streptococcus)群G；鏈球菌(Streptococcus)群C；鏈球菌(Streptococcus)群F；鏈球菌(Streptococcus)群B；鏈球菌(Streptococcus)群D；星群鏈球菌(Strep.constellatus)；中間鏈球菌(Strep.intermedius)；少酸鏈球菌(Strep.acidominimus)；牛鏈球菌(Strep.bovis)；咽峽炎鏈球菌(Strep.anginosus)；變異鏈球菌(Strep.mutans)；唾液鏈球菌(Strep.salivarius)；血鏈球菌(Strep.sanguis)；嗜熱鏈球菌(Strep.thermophilus)；緩癥鏈球菌(Strep.mitis)；馬鏈球菌(Strep.equi/equisim)；綠色鏈球菌(Strepviridans)；糞腸球菌(Enteroccocusfaecalis)；屎腸球菌(Enter.faecium)；鉛黃腸球菌(Enter.casseliflavus)；鶉雞腸球菌(Enter.gallinarum)；鳥腸球菌(Enter.avium)；耐久腸球菌(Enter.durans)；單核細胞增生利斯塔氏菌(List.monocytogenes)；白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)；藤黃微球菌(Micrococcusluteus)；玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)；淺綠氣球菌(Aerococcusviridans)；蠟狀芽孢桿菌(BacillusCereus)；溶血不動桿菌(Acinetobacterhaemolyticus)；鮑氏不動桿菌(Acinetobact.baumanni)；瓊氏不動桿菌(Acinetobact.junii)；魯氏不動桿菌(Acinetob...

【專利技術屬性】
技術研發人員：加利亞·漢諾特，德羅爾·萊德曼，哈桑·穆因丁，伊斯雷爾·漢諾特，
申請(專利權)人：奧普蒂庫爾診斷有限公司，奧普蒂庫爾診斷股份有限公司，
類型：發明
國別省市：以色列;IL