一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜與應用制造技術

本發明專利技術涉及一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜與應用，該指紋圖譜由6對基于金針菇基因組序列開發的SSR標記的特異等位片段組合而成。應用包括：對金針菇菌種進行SSR標記擴增，將得到的帶型與指紋圖譜對照，與該指紋圖譜一致即為三明BX3菌種。本發明專利技術與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短、準確性高、可重復性好的優點，在收集的我國24個主栽金針菇菌種中具有三明BX3菌種的專一性。

【技術實現步驟摘要】
一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜與應用
本專利技術屬于金針菇菌種的檢測領域，特別涉及一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜與應用。
技術介紹
金針菇[Flammulinavelutipes(Fr.)Sing.]又名金菇、樸菇、構菌、青杠菌、毛柄金錢菌，在分類上屬于傘菌目白蘑科小火焰菌屬。金針菇分布廣泛，營養豐富，是一種經濟價值很高的食用菌和藥用菌，也是市場上十分走俏的天然保健食品之一。金針菇是中國主要栽培食用菌和現代工廠化生產主要食用菌之一，2013年國內工廠化日生產量達到2700噸。優質菌種在金針菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了金針菇菌種在金針菇產業中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種知識產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑒定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是金針菇的生產構成了極大的威脅。就國內而言，金針菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國金針菇產業的發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對金針菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑒定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。面對這種局勢，就需要我們進一步加快菌種鑒定技術的研究，在金針菇的研究中建立更為有效的菌種鑒定體系。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用，該指紋圖譜與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。本專利技術的一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜，該指紋圖譜由6對SSR標記組成，是基于金針菇基因組簡單重復序列片段開發SSR引物，擴增帶型好，重復性高的SSR引物，標記詳細信息如表1。表1SSR標記詳細信息列表本專利技術的一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜的應用，是利用金針菇基因組簡單重復序列片段開發的6對SSR引物，通過對收集的24份國內主要金針菇栽培品種的SSR引物帶型擴增，本專利技術確定了6對SSR引物在金針菇三明BX3菌種中擴增出的等位片段的數量并編號(表2)，通過不同SSR等位片段的編號組合可有效識別三明BX3菌種(圖2-7)。通過對照50bpDNAladder可確定各SSR引物擴增的等位片段的相對分子量，存在三明BX3菌種特異SSR等位片段組合的菌種，即是金針菇三明BX3菌種，該菌種的編號組合為：1(1+3)(1+2+3+4)(2+3)(1+2)(2+3)。表2SSR引物擴增的等位片段信息匯總表有益效果本專利技術與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重復性好的優點。檢測所需時間只需要3～4天，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少2個月的時間；該方法在所收集的我國24個金針菇主栽菌種中具有三明BX3菌種的專一性，具有良好的應用前景。附圖說明圖1為金針菇三明BX3菌種SSR標記指紋圖譜，其中M是50bpDNAladder，數字代表的是所用的6對SSR引物，C是空白對照，箭頭所指的是金針菇三明BX3菌種的穩定且特異的SSR等位片段組合；圖2為引物Fv_fp0001在所選金針菇栽培材料中的擴增圖譜；圖3為引物Fv_fp0002在所選金針菇栽培材料中的擴增圖譜；圖4為引物Fv_fp0003在所選金針菇栽培材料中的擴增圖譜；圖5為引物Fv_fp0004在所選金針菇栽培材料中的擴增圖譜；圖6為引物Fv_fp0005在所選金針菇栽培材料中的擴增圖譜；圖7為引物Fv_fp0006在所選金針菇栽培材料中的擴增圖譜。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本專利技術。應理解，這些實施例僅用于說明本專利技術而不用于限制本專利技術的范圍。此外應理解，在閱讀了本專利技術講授的內容之后，本領域技術人員可以對本專利技術作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1(1)菌絲培養：將金針菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基中，19℃～21℃下避光搖瓶培養，3d～4d后收集菌絲；(2)基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：①將液氮冷凍干燥的金針菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45～60min，間或輕搖混勻；②12000rpm、4℃離心20min，取上清液；③在上述上清液中加入體積比為25：24：1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；④在上述離心管中加入體積比為24：1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；⑤在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；⑥將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2～3次，每次8000rpm，室溫離心5min；⑦加入預冷的95vol％乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；⑧加入100μL10×TE(Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；⑩將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用；(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20ng～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；PCR反應條件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30個循環；72℃5min。(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與12μL加樣緩沖液混勻，于95℃變性5min，結束后置于冰水混合物中冷卻3min，點樣3μL于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩沖液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結果。銀染的具體工藝為電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8秒，瀝干水分后，在銀染液(1.5克硝酸銀和1500ml水)中避光銀染8分鐘，銀染后，用去離子水水洗5-8秒，瀝干水分，放入顯影液(16克氫氧化鈉、1000ml水和8ml甲醛)中，至顯影后取出水洗后即可讀數。采用6對SSR引物對金針菇菌株進行PCR擴增，通過對照50bpDNAl本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種金針菇三明BX3菌種的SSR標記指紋圖譜，其特征在于：該指紋圖譜由6對基于金針菇基因組序列開發的SSR標記的特異等位片段組合而成，6對SSR標記在金針菇三明BX3菌種上擴增的等位片段信息具體為：Fv_fp0001的等位片段的數量為1，等位片段1相對于50bp?DNA?ladder的分子量為700bp；Fv_fp0002的等位片段的數量為2，等位片段1相對于50bp?DNA?ladder的分子量為1300bp，等位片段3相對于50bp?DNA?ladder的分子量為780bp；Fv_fp0003的等位片段的數量為4，等位片段1相對于50bp?DNA?ladder的分子量為1000bp；等位片段2相對于50bp?DNA?ladder的分子量為680bp；等位片段3相對于50bp?DNA?ladder的分子量為600bp；等位片段4相對于50bp?DNA?ladder的分子量為500bp；Fv_fp0004的等位片段的數量為2，等位片段2相對于50bp?DNA?ladder的分子量為1200bp；等位片段3相對于50bp?DNA?ladder的分子量為1100bp；Fv_fp0005的等位片段的數量為2，等位片段1相對于50bp?DNA?ladder的分子量為1100bp，等位片段2相對于50bp?DNA?ladder的分子量為800bp；Fv_fp0006的等位片段的數量為2，等位片段2相對于50bp?DNA?ladder的分子量為370bp；等位片段3相對于50bp?DNA?ladder的分子量為360bp。...

【技術特征摘要】
1.一種鑒定金針菇三明BX3菌種的方法，其具體步驟如下：(1)菌絲培養：將金針菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基中，19℃～21℃下避光搖瓶培養，3d～4d后收集菌絲；(2)基因組DNA的提取：用CTAB法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：①將液氮冷凍干燥的金針菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，于65℃保溫45～60min，間或輕搖混勻；②12000rpm、4℃離心20min，取上清液；③在上述上清液中加入體積比為25：24：1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；④在上述離心管中加入體積比為24：1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；⑤在上述離心管中加入2/3體積的-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；⑥將得到的沉淀用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2～3次，每次8000rpm，室溫離心5min；⑦加入預冷的95vol％乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干；⑧加入100μL10×TE緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；⑨加入1μL10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；⑩將得到的DNA提取物于-20℃冰箱貯藏備用；(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20ng～30ng/μL提取的模板DNA2μL，ddH2O10.4μL；PCR反應條件：94℃5min；94℃30second，55℃30second，72℃30second，30個循環；72℃5min；6對SSR引物如下：Fv_fp0001的正/反向引物分別為：AGAGCTGTCCATGTCTCGG/AGCGCTCGGTTTGATGAAC；Fv_fp0002的正/反向引物分別為：CTAGCCATGCAAAGGCGTC/CCAGCATGCGGTTTAGTCG；Fv_fp0003的正/反向引物分別為：CAGCTTTGAACAGGCGTCC/CTCCAAGCCAACACCTTGC；Fv_fp0004的正/反向引物分別為：GGCAGACGAGTGTGCTT...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王瑞娟，徐珍，尚曉冬，陸歡，章爐軍，張丹，譚琦，
申請(專利權)人：上海市農業科學院，
類型：發明
國別省市：上海;31