一種放射治療靶向增敏劑及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種放射治療靶向增敏劑，所述增敏劑由下列7種miRNAs構成：hsa-miR-138-2-3p模擬物；hsa-miR-208b-3p模擬物；hsa-miR-197-3p抑制物；hsa-miR-20b-3p抑制物；hsa-let-7a-5p抑制物；hsa-miR-16-1-3p抑制物；hsa-miR-21-5p抑制物；本發明專利技術提供了一種增加放療敏感性且毒副作用較輕的新型放療靶向增敏劑，特別應用于各期喉癌患者，具有重大的應用前景；本發明專利技術所提供的新型放射治療靶向增敏劑，預期在提高放療敏感性并進一步增加其療效方面，發揮較大的優勢，產生良好的經濟和社會效益。

【技術實現步驟摘要】
一種放射治療靶向增敏劑及其應用(一)
本專利技術涉及一種放射治療靶向增敏劑，特別涉及一種具有針對放射治療靶向增敏作用的miRNAs組合物及其應用。(二)
技術介紹
腫瘤干細胞是腫瘤中少數具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，且固有放射抵抗能力，一般認為腫瘤干細胞是腫瘤發生發展和放射抵抗的根源。近年來，人們已經成功分離鑒定近十種腫瘤干細胞；較為認可的“標志”細胞是流式細胞儀檢測的側群細胞(腫瘤干細胞樣細胞)和CD133+CD44+腫瘤細胞。目前有些研究已經深入到腫瘤干細胞的關鍵基因的調控。其中最為引人矚目的是腫瘤干細胞的微小RNA(microRNA，miRNAs)的研究。研究發現，miRNAs是腫瘤細胞內的最重要的基因調控分子之一，而腫瘤干細胞的miRNA特異性改變，可以從其對腫瘤干細胞靶基因的調控作用上體現出來。特異性miRNAs在腫瘤干細胞的特性方面起獨特而重要的調控作用，包括對生物學特性方面，如對放射抵抗基因的調控作用。可以推斷，放射特異的miRNAs在腫瘤干細胞放射抵抗中起到調控作用。miRNA已成為近年腫瘤學的研究熱點。喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤，也是呼吸道僅次于肺癌的第二位高發癌，多見于中老年男性。近年來，我國喉癌發病率呈上升趨勢。喉癌的治療以手術和放療為主，放療適用于有手術禁忌癥的患者、廣泛病變的術前控制、手術切緣不充分的補充治療等。對部分早期喉癌及低分化、未分化癌可作為首選治療措施。目前，對于腫瘤細胞放療增敏制劑已有一定的研究和臨床應用，如使用靶向藥物、化療藥物、中藥聯合放療，具有一定的增敏作用。但是，腫瘤細胞的放療抵抗仍然是嚴重困擾其放療效果的難題。目前，喉癌細胞尤其是喉癌干細胞中放療抵抗相關miRNAs調控的研究，國內外均未見報道。基于喉癌干細胞來源的具有高效增強喉癌放療敏感性的miRNAs組合制劑的開發研究具有前沿性和創新性。(三)
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種在放射治療中具有明顯增強放療敏感性和提高療效的miRNAs組合物(即放射治療靶向增敏劑，特別是針對喉癌放射治療靶向增敏劑)及其應用，較目前其他放療增敏制劑，其特異性和靶向性更強，作用機制更為廣泛，制劑的毒副作用更小。本專利技術采用的技術方案是：本專利技術提供一種放射治療靶向增敏劑，特別是針對喉癌放射治療靶向增敏劑，所述增敏劑由下列7種miRNAs構成：(1)hsa-miR-138-2-3pmimic：5’-GCUAUUUCACGACACCAGGGUU-3’、(2)hsa-miR-208b-3pmimic：5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’、(3)hsa-miR-197-3pinhibitor：5’-GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA-3’、(4)hsa-miR-20b-3pinhibitor：5’-CUGGAAGUGCCCAUACUACAGU-3’、(5)hsa-let-7a-5pinhibitor：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’、(6)hsa-miR-16-1-3pinhibitor5’-UCAGCAGCACAGUUAAUACUGG-3’(7)hsa-miR-21-5pinhibitor：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’(mimic指模擬物，inhibitor指抑制物)。進一步，本專利技術所述增敏劑由hsa-miR-138-2-3p模擬物、hsa-miR-208b-3p模擬物、hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物和hsa-miR-21-5p抑制物以質量比1:1:1:1:1:1:1混合制成。本專利技術還涉及一種所述放射治療靶向增敏劑在制備增癌放射治療敏感性藥物中的應用。本專利技術所述放射治療靶向增敏劑通常以轉染入目標細胞發揮作用，具體在體外將放射治療靶向增敏劑轉染入喉癌細胞，培養喉癌細胞放療增敏作用的方法為：人工合成hsa-miR-138-2-3p模擬物、hsa-miR-208b-3p模擬物、hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物和hsa-miR-21-5p抑制物，以24孔細胞培養板為例，(1)將上述人工合成的寡核苷酸以質量比1:1:1:1:1:1:1混合后，總質量為0.33μg、0.67μg、1μg，用DEPC水2.1μl、4.2μl、6.3μl溶解，分別加入22.9μl、20.8μl、18.7μl的RPMI1640培養液，制成總體積為25μl的RNA稀釋液；(2)將2μl的Entranstr-R與23μl的RPMI1640培養液混合，制成總體積為25μl的Entranstr-R稀釋液；將(1)、(2)制備的液體混合，制成50μl轉染復合物，加入含有5×105個喉癌細胞的450μl含有體積比為10％胎牛血清的RPMI1640培養基中；即制備成含放射治療靶向增敏劑總物質的量的濃度為50nM、100nM、150nM的轉染體系，優選所述轉染體系中增敏劑總物質的量的濃度100nM。本專利技術所述喉癌放射治療靶向增敏劑在不同容器中培養的用量：(a)細胞培養容器，(b)每孔可獲細胞數，(c)每孔增敏劑總質量，(d)每孔DEPC水體積，(e)每孔RNA稀釋液總體積，(f)每孔Entranstr-R體積，(g)Entranstr-R稀釋液總體積，(h)每孔細胞培養基總體積。注：每孔組合物增敏劑總物質的量的濃度為100nM。本專利技術所述具有靶向調控喉癌放射治療敏感性的增敏劑為含兩種具有上調喉癌放療敏感性的寡核苷酸模擬物(hsa-miR-138-2-3p模擬物、hsa-miR-208b-3p模擬物)和五種具有下調喉癌放射抵抗性寡核苷酸抑制物(hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物、hsa-miR-21-5p抑制物)的混合制劑。本專利技術要點在于培養喉癌干細胞，通過臨床常用劑量放射治療后，篩選出具有2倍以上差異的miRNAs，具有2倍上調表達的miRNAs認為是可能具有增加放射抵抗性的miRNAs，具有2倍下調表達的miRNAs認為是可能具有增加放療敏感性的miRNAs，并結合miRBase等數據庫，篩選出可能性較大的具有調節喉癌放療效應的2種具有2倍下調表達的miRNAs和5種具有2倍上調表達的miRNAs，并明確其核苷酸序列。合成具有2倍下調表達miRNAs的模擬物和具有2倍上調表達miRNAs的抑制物。將上述7種合成的寡核苷酸按等質量比組成miRNAs靶向放療增敏劑，同時設立無義miRNA組、PBS組、空白組作為對照，應用納米聚合物轉染制劑將上述增敏劑、無義miRNA、PBS高效轉染至體外培養的喉癌細胞內。將增敏劑組、無義miRNA組、PBS組、空白組喉癌細胞按臨床常用劑量進行放射治療，觀察放療后，轉染增敏劑組的喉癌細胞較對照組在喉癌增殖、侵襲、凋亡等生物學行為的差異，以驗證喉癌放療靶向增敏劑的療效及毒副作用。本領域技術人員，可通過培養喉癌干細胞、篩選調節放療敏本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種放射治療靶向增敏劑，其特征在于所述增敏劑由下列7種miRNAs構成：(1)hsa?miR?138?2?3p模擬物：5’?GCUAUUUCACGACACCAGGGUU?3’、(2)hsa?miR?208b?3p模擬物：5’?AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU?3’、(3)hsa?miR?197?3p抑制物：5’?GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA?3’、(4)hsa?miR?20b?3p抑制物：5’?CUGGAAGUGCCCAUACUACAGU?3’、(5)hsa?let?7a?5p抑制物：5’?AACUAUACAACCUACUACCUCA?3’、(6)hsa?miR?16?1?3p抑制物：5’?UCAGCAGCACAGUUAAUACUGG?3’(7)hsa?miR?21?5p抑制物：5’?UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA?3’。

【技術特征摘要】
1.一種放射治療靶向增敏劑，其特征在于所述增敏劑由下列7種miRNAs構成：(1)hsa-miR-138-2-3p模擬物：5’-GCUAUUUCACGACACCAGGGUU-3’、(2)hsa-miR-208b-3p模擬物：5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’、(3)hsa-miR-197-3p抑制物：5’-GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA-3’、(4)hsa-miR-20b-3p抑制物：5’-CUGGAAGUGCCCAUACUACAGU-3’、(5)hsa-let-7a-5p抑制物：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’、(6...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃常新，朱影，
申請(專利權)人：杭州師范大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33