一種適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基制造技術

本發明專利技術公開了一種適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基，所述CHMM1培養基以適用于表皮黑素細胞體外培養的基礎培養基為基質，所述基質中添加有下列組分：(1)體積濃度5％～20％的血清、(2)1～100ng/mL?bFGF和1～100ng/mL?GM-CSF(3)1～100μg/mL的異甲基黃嘌呤(IBMX)和3～3000ng/mlα-MSH；本發明專利技術提供了適于中國人表皮黑素細胞的體外培養的培養基，可用于培養增殖能力和黑素合成能力增強的表皮黑素細胞，以更好的應用于移植治療色素減退或無色素性皮膚病患者。

【技術實現步驟摘要】
一種適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基(一)
本專利技術涉及一種適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基。(二)
技術介紹
人類皮膚顏色的變化是黑素體的數目、大小、類型和分布有著直接的關系。皮膚顏色主要由皮膚制造的色素和皮膚表層所含天然色素的組合所決定。皮膚上皮層表面的表皮中含有能制造皮膚色素(即黑色素)的表皮黑素細胞。色素減退或無色素性皮膚病患者的皮膚黑素細胞缺失、被破壞或無功能，從而在身體各部位出現白斑。黑素是一種蛋白衍生物，由表皮的黑素細胞產生。目前認為參與皮膚黑素的形成和代謝的尚有表皮的角質形成細胞，黑素細胞和角質形成細胞合稱為表皮黑素單位，它是由一個黑素細胞與其鄰近的約36個角質形成細胞所組成的。黑素細胞通過樹突分泌黑素進入鄰近的角質形成細胞，隨著角質形成細胞的代謝(表皮細胞向上移行)，黑素也不斷向上轉運，逐漸降解，最終脫落于表皮。黑素代謝中，這樣的一個動態的過程，全是由無數具有此功能的結構單位——表皮黑素單位來完成。黑素生成的過程中，各種因素都可影響其生成的速度及種類。其中體內的各種細胞因子、微量元素、酶活性、神經激素水平及黑素細胞周圍的物理化學環境均可影響黑素的生物合成。酪氨酸酶是黑素代謝中目前唯一已明確的酶，是一種含銅需氧酶，其活性與銅離子含量成正比例。酪氨酸酶家族包括TYR、TRP-1和TRP-2，它們編碼的蛋白質一級結構相似，卻在黑素合成的調控上起著不同的作用。此酶活性過程與體內生化過程和物理環境有密切聯系，因而影響黑素合成的機制是相當復雜的，除遺傳(酪氨酸酶先天性缺陷)因素外，其他較明確和重要的有以下幾方面：1)微量元素微量元素在黑素代謝中主要起觸酶作用，其中以銅離子和鋅離子較為重要，若缺乏均可使動物毛變白。銅離子參與黑素合成過程時，需借泛酸將其與酪氨酸酶結合，以便黑素形成過程能正常進行。某些重金屬(如砷、鉍、銀、金等)引起皮膚色素沉著，可能是通過與巰基結合，使酪氨酸酶的活性增強所致。2)氨基酸及維生素動物實驗中表明，酪氨酸、色氨酸及賴氨酸等在黑素形成中是必需的。泛酸、葉酸、生物素、對氨苯甲酸等也可能參與黑素的形成。維生素C系還原劑在黑素代謝中可使深色氧化型醌式產物還原，從而使色素轉淡。維生素A缺乏引起的毛囊角化過度而是巰基減少，引起色素沉著。煙酸缺乏可對光敏感而出現色素沉著。3)內分泌因素如垂體中葉分泌的促黑素激素(MSH)可能是通過提高血中銅離子水平而使酪氨酸酶的活性增高而促進黑素的形成；腎上腺皮質激素則通過抑制垂體分泌MSH而減少黑素的形成；性激素可使皮膚色素增加，特別是雌激素能刺激黑素細胞分泌黑素體，而孕激素促使期轉運擴散，連著的聯合作用往往更明顯；甲狀腺可作為氧化劑而使黑素形成增多。4)細胞因子角質形成細胞表面所表達的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是人類黑素細胞的天然絲裂原，可直接作用與黑素細胞，促進期增殖并合成黑素。影響黑素合成的主要分子信號通路--cAMP/PKA通路:激活劑與膜受體結合之后，腺苷酸環化酶通過細胞內三聚體G蛋白被激活，并且AMP轉化為cAMP，激活cAMP依賴蛋白激酶(PKA)。PKA的活性可被cAMP依賴蛋白酶抑制劑(PKI)所抑制。在活體或培養的色素細胞,黑素生成可被α-MSH或cAMP提高因子，如二丁酰cAMP、forskolin(毛喉素，一種腺苷酸環化酶直接激活劑)和IBMX(一種磷酸二酯酶抑制劑)所刺激。它是通過增強酪氨酸酶蛋白和信使數量，刺激酪氨酸酶活性。并且黑素細胞的特殊轉錄因子(MITF)，結合一些調節因子共同調節酪氨酸酶啟動因子的轉錄活性，從而cAMP提高因子調節黑素的生成。黑色素不但具有保護作用，在皮膚美學上也至關重要。某些疾病可引起局部黑素細胞破壞、缺失或細胞功能受抑制，影響皮膚色素制造系統，從而導致皮膚色素減退或者色素缺失。此種異常會造成患者心理學和社會學的嚴重損害。白癜風是一種特殊的皮膚色素性疾病，以出現白斑和表皮黑素細胞缺失為主要特征。當前治療包括光敏劑(如補骨脂素)聯合UVA照射、窄波UVB照射或者局部使用(腎上腺)皮質類固醇，但療效低，并伴隨一定副作用(ShaffaliandGawkrodger,2000,ClinExpDermatol25:575)。外科移植技術已經應用于白癜風治療，如負壓吸皰移植、刃厚皮片移植或微小皮片移植，甚至是移植人造表皮(Kogaetal.,1988,ArchDermatol124:1656；Guptaetal.,1999,DermatolSurg25:955；Falabella,1984,JDermatolSurgOncol10:136；Suvanprakornetal.,1985,JAmAcadDerm13:968；Sarkaretal.,2001,JDermatol28:540；Paietal.,2002,J.EurAcadDermatolVenereol16:604)。這些治療在局限性和小面積病損的患者中有效，但對白斑面積大或者白斑數量多的患者，獲得足夠的移植皮片具有一定困難(VanGeel,N.etal.,2001,Dermatology202:162)。人造表皮可以治療大面積白癜風，但是黑素細胞活性難以保證，復色不佳，目前僅適用于個別白癜風適應癥。目前可通過細胞培養大量擴增自體黑素細胞用于移植。這種方法需要從病人健康皮膚取得黑素細胞，在體外將其培養在合適環境中(可促進細胞增殖和黑素制造)使之大量擴增，再在合適條件下將細胞移植至病人病變處皮膚,使之恢復正常顏色。Lerner等(1987,JInvestDerm89:219)介紹了黑素細胞移植治療斑駁病(一種遺傳疾病，以先天性缺乏黑色素細胞導致皮膚白斑和白發為特點)。通過皮切活檢術獲得一小塊皮膚，用含有TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)，異甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX),霍亂毒素及新生牛血清的培養基培養表皮黑素細胞。雖然細胞成功地移植到了色素減退區域，但由于培養基中含有TPA，使這種培養基不適合用于人類移植。目前國內外在臨床使用的培養基主要有M2、TIC、Hu16、MK、MBM、MCDB153等，上述培養基雖然以bFGF替代了有潛在致癌性的TPA，但由于bFGF的濃度低，且缺少cAMP的激動劑，因此培養的黑素細胞活性差(培養的細胞只有50％可以用來移植)，從而導致臨床療效低；同時培養基中添加了有毒的霍亂毒素(CT)，臨床使用缺乏安全性。Olsson等(1992,Lancet340:981)報告的表皮黑色素細胞培養基配方，包含PC-1，bFGF，丁酰環腺苷酸(dbcAMP)，青霉素-鏈霉素。該培養基用于在自體黑素細胞移植中擴增分離到的表皮黑色素細胞。此培養基不包含促進黑色素細胞生長和分化必需的血清。此外，bFGF的濃度(5ng/ml)太低，不能刺激表皮黑色素細胞作足夠的生長。而dbcAMP不是一種天然物質，作用時間也很短。另外，對所培養細胞的數量和黑素含量均無量化指標報道，因此，很難評價這一培養基的效率。值得注意的是，Olsson等后來己使用非培養的表皮黑色素細胞移植治療白癜風(OlssonandJuh本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基，所述CHMM1培養基以適用于表皮黑素細胞體外培養的基礎培養基為基質，所述基質中添加有下列組分：(1)體積濃度5％～20％的血清；(2)1～100ng/mL的bFGF和1～100ng/mL的GM?CSF；(3)1～100μg/mL的異甲基黃嘌呤和3～3000ng/mlα?MSH。

【技術特征摘要】
1.一種適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基，其特征在于所述CHMM1培養基組成為體積濃度5％～20％的血清，1～100ng/mL的bFGF，1～100ng/mL的GM-CSF，1～100μg/mL的異甲基黃嘌呤和3～3000ng/mlα-MSH，0.1～5mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為下列之一：Ham'sF12培養基、RPMI培養基或DMEM培養基。2.如權利要求1所述適于中國人表皮黑素細胞體外培養的CHMM1培養基，其特征在于所述血清體積濃度10％～15％；...

【專利技術屬性】
技術研發人員：許愛娥，林福全，
申請(專利權)人：許愛娥，
類型：發明
國別省市：浙江;33