表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法技術

本發明專利技術提供了一種表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法。該方法包括：(1)構建具有編碼RANK胞外區域的cDNA的載體，將該載體轉化到原核細胞中，從而得到以包涵體形式表達的重組RANK；(2)對該包涵體進行超聲處理，然后重新溶解在6M的鹽酸胍中，得到解離狀態的重組RANK；(3)重新折疊重組RANK；(4)將上清液利用瓊脂75柱進行分離；(5)通過SDS-PAGE收集并分析正確折疊的RANK。本發明專利技術提供的方法尤其適用于鼠RANK胞外區域蛋白的表達與純化。

【技術實現步驟摘要】
表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法本申請是基于申請日為2009年3月26日、申請號為200910080733.X、專利技術創造名稱為“鼠RANK/RANKL胞外復合體的晶體，制備其的方法及其應用”專利申請的分案申請。
本專利技術涉及純化和表達RANK胞外蛋白的方法，還提供了一種RANK/RANKL復合體的晶體，尤其提供了一種鼠RANK/RANKL胞外蛋白形成的晶體。本專利技術提供了一種制備鼠RANK/RANKL胞外復合體晶體的方法，以及該復合體結構在醫藥領域中的應用。
技術介紹
腫瘤壞死因子(TNF)家族中的細胞因子在諸如炎癥反應、器官發生、宿主防御、自身免疫和細胞凋亡等多種生物功能中扮演著重要的角色。這些生物調節因子是通過受體-配體相互作用，從而引發細胞內的信號傳遞以及細胞表型的改變而發揮相應的生理作用的。作為TNF家族成員的RANKL以及其受體RANK在生物體內的多種活動中扮演著重要的角色，其對于骨的重塑過程起到了重要的調節作用，并且RANK以及RANKL分子之間的相互作用還可調節T細胞/樹突狀細胞的信號傳導、樹突狀細胞的存活以及淋巴組織的發育，近年來受到了廣泛的關注。在人體骨的重塑過程中，破骨細胞是骨重塑的“啟動子”，成骨細胞是骨重塑的“調節者”，骨吸收類疾病共同的病理特征為破骨細胞調節異常導致骨形成和骨吸收之間喪失平衡，因此深入了解破骨細胞的激活機制將對于成功防治骨吸收類疾病的發生有著至關重要的意義。1997年，幾個不同的研究小組發現了腫瘤壞死因子受體-配體超家族新成員：骨保護蛋白(osteoprotegerin,OPG)、RANKL以及RANK；隨后，多項研究相繼顯示：RANKL、OPG具有調節破骨細胞分化、發育、影響其功能的作用，RANK是RANKL、OPG發揮作用的關鍵，它們形成一個骨調節軸，來調節骨的重塑過程。RANKL為一種II型跨膜蛋白，其多為三個單體聚合成的復合體，主要分布在活化T細胞、骨髓基質細胞及成骨細胞等細胞中，目前認為哺乳動物中存在三種RANKL蛋白：RANKL1、RANKL2、RANKL3，其中前兩種為膜結合蛋白，后一種為被分泌到胞外的可溶性蛋白。人和大鼠的RANKL分子分別包含317、316個氨基酸殘基，具有87％的同源性；人類RANKL基因位于13q14，其啟動子區包含成骨細胞分化的關鍵轉錄因子cbaf-1的活性。RANKLmRNA可在多種組織表達，以骨骼和淋巴組織中最高，在骨骼中，RANKL主要表達于骨小梁和骨髓；在骨髓基質細胞和成骨細胞均可檢測到RANKLmRNA。2004年ItoS等人以及國際專利申請NO.WO03/014077都披露了RANKL的三維結構，其全部內容結合于此作為參考。各項研究表明：每一個RANKL單體包括一個夾層結構，其由兩個平面反平行β-折疊片層構成。第一個片層由β-鏈A”、A、H、C及F組成，第二個片層由B’、B、G、D及E組成，其中第一片層為內層β-片層，該片層富含疏水性氨基酸，并通過疏水作用與另外兩個RANKL相互結合，而B’、B、G、D及E鏈形成外層β-片層，該片層多為帶電及極性氨基酸，負責與受體RANK結合；每一個RANKL單體中的β-夾層結構的一個邊緣、鏈E及F包裹相鄰單體的AHCFβ-片層的內部疏水層從而形成RANKL三聚體結構。RANKL三聚體的晶體結構特征是：具有P212121的空間群，晶胞參數為以及空間群R3，胞晶為其形狀就像被截平了的錐形，靠近膜的一端寬于遠端的頂點處。RANKL三聚體高底部直徑約為頂點處的直徑約為RANK是RANKL的受體，屬于TNF受體家族，是一種I型跨膜蛋白，人RANK分子在破骨細胞前體細胞和成熟破骨細胞內表達量較高。RANK基因定位于18q22.1，其編碼的蛋白質在體內以跨膜蛋白型存在，其表達于單核-巨噬細胞系、破骨細胞前體細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞等，表達于破骨細胞前體細胞膜表面的RANK介導RANKL的信號，發揮調節破骨細胞分化的功能。當配體RANKL與受體RANK的胞外區域結合后，導致了RANK的激活，活化后的RANK通過其胞內區域的TRAF結合域與TRAF1、2、3、5、6等蛋白結合，并且通過這些TRAF蛋白激活細胞內的兩條重要的信號通路：JNK/SAPK通路和NFκB信號通路。這兩條信號通路的激活誘導了與破骨細胞分化相關的基因的表達，最終促進了破骨細胞的分化與成熟。而且，各種骨代謝調節因子、激素參與RANKL-RANK-OPG軸信號的調節。與其它信號途徑一樣，RANKL-RANK-OPG軸信號也存在正反饋和負反饋調節。1α,25-(OH)2D3、甲狀旁腺素、前列腺素E2、白介素1、IL-6等骨吸收因子分別通過維生素D受體介導通路、蛋白激酶A介導通路、gp130/STAT介導通路上調成骨細胞/骨髓基質細胞RANKLmRNA表達；IL-1、TNF-α分別通過激活破骨細胞表面的IL-1R和TNFR1加強RANKL信號；TGF-β則可增加破骨細胞表面的RANK上調RANKL信號。作為RANKL-RANK-OPG信號系統調控破骨細胞分化的中心環節，RANKL與RANK之間的相互作用及其促使RANK活化的微觀機制一直以來是骨吸收類疾病研究領域的熱點問題。其焦點問題之一是RANKL、RANK蛋白以及RANKL-RANK復合體的晶體結構。雖然目前已經獲得了RANKL蛋白的晶體結構，但是仍然沒有獲得RANK蛋白以及RANK/RANKL復合體的晶體結構，正是由于對該結構的認識不足，所以學者們對于RANKL-RANK-OPG信號體系如何被調控，以及受調控后RANKL-RANK-OPG執行信號傳遞的微觀機制尚無明確的認識。這嚴重影響了有關骨吸收類疾病致病機制的探索以及抗骨吸收藥物的研究。分析目前還未獲得RANK蛋白以及RANKL-RANK復合體的晶體結構的原因主要有以下兩點：1.RANK蛋白較難于制備和純化。在RANK被發現至今的時間里，一直無RANK蛋白E.coli表達以及純化的相關報道。2.相對于包含RANKL在內的TNF蛋白家族成員所具有的較剛性的結構，包括RANK在內的TNFR蛋白家族成員其結構具有較大的可變性，因而更難于獲得結晶。
技術實現思路
本專利技術提供了一種蛋白復合體晶體，其中所述復合體包括鼠RANK/RANKL胞外區域蛋白的氨基酸序列。所述鼠RANKL的胞外區域是指所述RANKL單體C-末端從161位氨基酸至316位氨基酸，所述RANK的胞外區域是指所述RANK單體N-末端從26位氨基酸至210位氨基酸。根據本專利技術提供的鼠RANK/RANKL復合體晶體中，所述晶體屬于P63六邊形空間群組，晶胞尺寸是和在本專利技術提供的晶體中，該復合體包括由三個RANKL單體鏈形成的三聚體內核，以及另三個RANK單體鏈。RANK單體鏈分別結合在RANKL三聚體內核上，從而形成六聚體。每個RANK受體結合到由相鄰兩個RANKL配體亞單位形成的裂縫中；該六聚體復合體具有的溶劑可及表面積，由RANK貢獻RANKL貢獻在本專利技術提供的晶體中，RANK單體鏈的環120S(即殘基122-127)完全與配體RANKL結合，在RANK單體鏈的兩個區域，即殘基182-185，以及殘基194-196形成2個短的β-片層構象本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法，包括：(1)構建具有編碼RANK胞外區域的cDNA的載體，將所述載體轉化到原核細胞中，從而得到以包涵體形式表達的重組RANK；(2)對所述包涵體進行超聲處理，然后重新溶解在6M的鹽酸胍中，得到解離狀態的所述重組RANK；(3)重新折疊所述重組RANK，所述重新折疊的過程包括：將所述包涵體稀釋在包含20mM、pH值為7.3的Na2HPO4、1M?L?精氨酸、20％甘油、10mM還原型谷胱苷肽以及1mM氧化型谷胱苷肽的復性(IB)溶液中，得到第一復性液；將所述第一復性液稀釋在含有20mM、pH值為7.3的Na2HPO4、0.5M?L?精氨酸、10％甘油的重新折疊緩沖液1中4℃下透析12小時，得到第二復性液；將所述第二復性液稀釋在含有20mM、pH值為7.3的Na2HPO4、0.2M?L?精氨酸、5％甘油的重新折疊緩沖液2中4℃下透析12小時，得到第三復性液；將所述第三復性液稀釋在20mM、pH值為7.3的Na2HPO4、0.2M?L?精氨酸中4℃下透析12小時，得到第四復性液；將所述第四復性液離心，得上清液；(4)將所述上清液利用瓊脂75柱進行分離；(5)通過SDS?PAGE收集并分析正確折疊的RANK。...

【技術特征摘要】
1.一種表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法，包括：(1)構建具有編碼RANK胞外區域的cDNA的載體，將所述載體轉化到原核細胞中，從而得到以包涵體形式表達的重組RANK；所述RANK的胞外區域是指鼠RANK單體N-末端從26位氨基酸至210位氨基酸的區域；所述鼠RANK單體的氨基酸序列為：MAPRARRRRQLPAPLLALCVLLVPLQVTLQVTPPCTQERHYEHLGRCCSRCEPGKYLSSKCTPTSDSVCLPCGPDEYLDTWNEEDKCLLHKVCDAGKALVAVDPGNHTAPRRCACTAGYHWNSDCECCRRNTECAPGFGAQHPLQLNKDTVCTPCLLGFFSDVFSSTDKCKPWTNCTLLGKLEAHQGTTESDVVCSSSMTLRRPPKEAQAYLPSLIVLLLFISVVVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESSGDRCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEKMVPEDGAGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQGDLSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPPFQEPLEVGENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIEGDSCLPWVVSSNSTDGYTGSGNTPGEDHEPFPGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNSTFISSG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：唐佩福，劉長振，黃鵬，張世謙，高斌，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院，北京表源生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11