亞全能干細胞的制備方法技術

本發明專利技術公開了亞全能干細胞的制備方法，包括如下步驟：組織的獲得，消毒處理，組織的分離、洗滌和剪碎，膠原酶消化，亞全能干細胞的獲得。本發明專利技術公開了一種從臍帶、胎盤羊膜、絨毛膜或基蛻膜組織中分離亞全能干細胞的方法，獲得的亞全能干細胞均一、穩定、生長周期短。

【技術實現步驟摘要】
亞全能干細胞的制備方法
本專利技術涉及干細胞工程
，具體涉及一種亞全能干細胞的制備方法。
技術介紹
干細胞是一類具有自我更新能力且在適合微環境下具有多系分化潛能的原始細胞。根據個體發育過程中出現的先后次序不同，干細胞可分為胚胎干細胞、新生兒干細胞和成體干細胞，按照干細胞分化潛能的不同，可以分為全能干細胞、亞全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。目前，已有利用干細胞治療心肌梗塞、紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、神經損傷和肌肉萎縮等。亞全能干細胞是指具有三胚層分化潛能的一類干細胞亞群，在特定環境下，理論上可以誘導分化為人體任何一種組織細胞，主要來源于人體中廣泛存在的間充質組織，特別是骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等間充質組織，由于臍帶和胎盤來源的亞全能干細胞具有更為原始和更為強大的增值能力，較強的分化能力，低免疫原性和免疫調節功能，其在臨床上的應用價值越來越受人們關注。作為要應用于臨床細胞治療的細胞產品，應當具有如下特點：組織取材方便，來源廣泛，不受倫理限制；分離過程簡單，無外源污染引入；外來添加物少，過程可控性強，重復性好；可獲得足夠細胞，細胞活力好；培養周期短，成本低。目前亞全能干細胞的制備過程中，獲得的亞全能干細胞不穩定，且需要多次傳代才可獲得足夠的干細胞，因此生長周期長。現有技術《人臍帶間充質干細胞及其制備方法》(CN102127522)使用到了含抗生素Hanks′BalancedSaltSolution和D‐PBS溶液，成本高而且是科研研究用的，引入不要的風險。其還使用II型膠原酶、IV型膠原酶、II型膠原酶和胰酶混合液、或II型膠原酶和透明質酸酶混合液中的一種。消化時間長達6小時且效果一般。現有技術《一種利用胎盤小葉組織制備亞全能干細胞的方法》(申請號201310170574.9)。方法復雜且用到牛血清等試劑。
技術實現思路
本專利技術的目的提供亞全能干細胞的制備方法，解決上述現有技術問題中的一個或者多個。根據本專利技術的一個方面，亞全能干細胞的制備方法，包括如下步驟：亞全能干細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1分離、洗滌和剪碎臍帶組織，預處理提高制備效果。步驟2膠原酶消化：配制0.1～2％的膠原酶，加入經步驟2的臍帶組織，在37℃、150rpm震蕩消化10～60min，得細胞懸液；步驟3)亞全能干細胞的獲得：向步驟2離心管內補加等量生理鹽水，經150目篩網過濾，收集細胞初懸液，將細胞初懸液進行梯度離心，細胞初懸液梯度離心分為三個梯度，分別是2000rpm、10min，1500rpm、10min，1200rpm、10min，取梯度離心得到的細胞沉淀加入培養基重懸，得到細胞懸液即為亞全能干細胞。使用此特點參數分離效果好對細胞傷害小。獲得的亞全能干細胞均一、穩定、生長周期短。在一些實施方式中，組織的分離、洗滌和剪碎的步驟中，組織最優剪碎時間為10～15min，最優剪碎大小為2～3mm3。在一些實施方式中，膠原酶消化的步驟中，膠原酶的最優濃度為0.5％，37℃，最優消化時間為15～25min。由此消化時間縮短，消化效果仍可保證，且對細胞傷害小見表一和圖1～7。在一些實施方式中，分離、洗滌和剪碎臍帶組織操作前進行消毒處理。由此即使臍帶組織采集環境條件不同，環境可能無法達到完全無菌的條件仍然可以保證亞全能干細胞提取安全。在一些實施方式中，消毒處理方法為臍帶兩端結扎后，放入75％的酒精中浸泡1～2min，用0.9％生理鹽水清洗2～3次；胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面用75％的酒精棉順時針擦拭，重復一遍。不使用抗生素并根據組織特性消毒。在一些實施方式中，分離、洗滌和剪碎臍帶組織方法為：臍帶剔除一根臍靜脈和兩根臍動脈，獲得華通氏膠，將羊膜從胎盤上剝離，取下羊膜后剝離絨毛主干和游離絨毛膜末端的基蛻膜，將不同的組織放入無菌皿內，再使用0.9％生理鹽水洗滌，去除殘余的紅細胞，將處理好的組織放入離心管內，用鈍頭無菌剪剪成0.5～5mm3小塊，剪碎時間為10～40min。膠原酶P，其作用是消化細胞間的膠原組織，加速細胞解離出來，不對細胞產生破壞。選用這種特定酶經過大量實踐篩選。華通氏膠為構成臍帶的凝膠狀物質，主要成份是黏多糖(Mucopolysaccharides)，也含有成纖維細胞和巨噬細胞，是一種黏膜組織。當嬰兒分娩后，溫度的改變使華通氏膠內部的結構發生蹋陷，從而鉗住臍帶內的血管，此過程一般持續約五分鐘。華通氏膠內的部份細胞具有干細胞的特質。本專利技術提供的亞全能干細胞的制備方法，還有以下優點：本專利技術可從一種從臍帶、胎盤羊膜、絨毛膜或基蛻膜組織中分離亞全能干細胞。本專利技術組織樣本經過組織表面消毒和組織樣本的反復洗滌處理，避免采集環節出現的污染。本專利技術樣本組織洗滌液為醫用0.9％的生理鹽水，而非科研研究用的杜氏磷酸緩沖液(DPBS)等，易于后續使用。本專利技術的干細胞分離技術結合專門的培養基，使細胞經過一次傳代就可以獲得足夠的干細胞用于儲存。細胞凍存代數越早，細胞的增殖，活力，分化能力就越好。附圖說明圖1為0.5％膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細胞活力圖；圖2為0.1％膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細胞活力圖；圖3為2％膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細胞活力圖；圖4為0.5％膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細胞24h換液后細胞長勢圖；圖5為0.1％膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細胞24h換液后細胞長勢圖；圖6為2％膠原酶P濃度作用下獲得的亞全能種子細胞24h換液后細胞長勢圖；圖7為本專利技術提取的亞全能干細胞表面標志物檢測結果。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下面對本專利技術作進一步詳細說明。實施例1組織的獲得：將新生兒的臍帶，置于無菌條件下，在12h內分離，胎盤取自足月健康孕婦，孕婦HBV抗原、抗HCV抗體，抗HIV抗體、抗梅毒螺旋體抗體、ALT、支原體等檢測項目均為陰性，胎盤自手術臺取下后，浸在含有抗生素的0.9％的生理鹽水里，維持在4℃的環境下保存；消毒處理：臍帶兩端結扎后，放入75％的酒精中浸泡1～2min，用0.9％生理鹽水清洗2～3次，剔除組織表面殘留的血液；胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面用75％的酒精棉順時針擦拭，重復一遍；環境可能無法達到完全無菌的條件仍然可以保證亞全能干細胞提取安全，臍帶與胎盤羊膜面、絨毛膜、基蛻膜面根據其特性所以消毒處理不同，臍帶可以酒精浸泡，胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面脆弱不可浸泡酒精。組織的分離、洗滌和剪碎：臍帶剔除一根臍靜脈和兩根臍動脈，獲得華通氏膠，將羊膜從胎盤上剝離，取下羊膜后剝離絨毛主干和游離絨毛膜末端的基蛻膜，將不同的組織放入無菌皿內，再使用0.9％生理鹽水洗滌3次，去除殘余的紅細胞，將處理好的組織放入50ml的離心管內，10ml/管，用鈍頭無菌剪剪成1～3mm3小塊，剪碎時間為10～15min；膠原酶消化：配制0.5％的膠原酶，在離心管中加入0.5％的膠原酶充分混勻，在37℃、150rpm震蕩消化15～25min。不同酶濃度作用下獲得的亞全能種子細胞數和活力的比較見表一。表一:不同酶濃度作用下獲得的亞全能種子細胞數和活力的比較膠原酶P濃度0.5％0.1％2％消化時間25min1h10min組織量10ml10ml10ml原始種子數(個)4～本文檔來自技高網...

【技術保護點】
亞全能干細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟1分離、洗滌和剪碎臍帶組織；步驟2膠原酶消化：配制0.1～2％的膠原酶，加入經步驟2的臍帶組織，在37℃、150rpm震蕩消化10～60min，得細胞懸液；步驟3亞全能干細胞的獲得：向步驟2離心管內的細胞懸液補加等量生理鹽水稀釋，經150目篩網過濾，收集細胞初懸液，將細胞初懸液進行梯度離心，細胞初懸液梯度離心分為三個梯度，分別是2000rpm、10min，1500rpm、10min，1200rpm、10min，取梯度離心得到的細胞沉淀加入培養基重懸，得到細胞懸液即為亞全能干細胞懸液。

【技術特征摘要】
1.亞全能干細胞的制備方法，其特征在于，由如下步驟組成：步驟1分離、洗滌和剪碎臍帶組織，所述分離、洗滌和剪碎臍帶組織方法為：臍帶剔除一根臍靜脈和兩根臍動脈，獲得華通氏膠，將羊膜從胎盤上剝離，取下羊膜后剝離絨毛主干和游離絨毛膜末端的基蛻膜，將不同的組織放入無菌皿內，再使用0.9％生理鹽水洗滌，去除殘余的紅細胞，將處理好的組織放入離心管內，用鈍頭無菌剪剪成0.5～5mm3小塊，剪碎時間為10～40min，所述步驟1分離、洗滌和剪碎臍帶組織操作前進行消毒處理，所述消毒處理方法為臍帶兩端結扎后，放入75％的酒精中浸泡1～2min，用0.9％生理鹽水清洗2～3次；胎盤羊膜面、絨毛膜和基蛻膜面用75％的酒精棉順時針擦拭，重復一遍；步驟2膠原酶消化：配制0...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王軍霞，黃福來，
申請(專利權)人：黃福來，
類型：發明
國別省市：福建;35