用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)尤其涉及可用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的非人脊椎動(dòng)物例如小鼠和大鼠，其中的內(nèi)源性抗體鏈表達(dá)已經(jīng)失活。這一失活導(dǎo)致定位于嚙齒類重鏈基因座內(nèi)的ADAM6基因丟失，所述基因?qū)τ允侵陵P(guān)重要的。導(dǎo)入所述ADAM6基因的功能性拷貝使得可育的小鼠可以產(chǎn)生。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本專利技術(shù)尤其涉及可用于生產(chǎn)具有人可變區(qū)的抗體的可育的非人脊椎動(dòng)物例如小鼠和大鼠，其中的內(nèi)源性抗體鏈表達(dá)已經(jīng)失活。
技術(shù)介紹
包含一或多個(gè)編碼可變區(qū)的轉(zhuǎn)基因抗體基因座的產(chǎn)生抗體的非人脊椎動(dòng)物例如小鼠和大鼠通常是本領(lǐng)域已知的，其通過以WO2011004192、US7501552、US6673986、US6130364、WO2009/076464和US6586251為例的參考文獻(xiàn)的方式產(chǎn)生，上述參考文獻(xiàn)以引文形式全文并入本文。使用胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)技術(shù)，本領(lǐng)域提供具有轉(zhuǎn)基因抗體基因座的非人脊椎動(dòng)物，例如小鼠和大鼠，可以在以人抗原攻擊(challenge)后從其中產(chǎn)生人或嵌合抗體。這些抗體在其重鏈中，任選地也在其輕鏈中有效地具有人可變區(qū)。同時(shí)，為避免內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)的復(fù)雜化，通常對這些脊椎動(dòng)物的基因組進(jìn)行工程化，以便使內(nèi)源性重鏈表達(dá)失活。用于此的技術(shù)包括刪除全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，同時(shí)或在另一步驟中插入人VDJ基因區(qū)段(例如，見WO2009076464和WO2002066630)。這些刪除導(dǎo)致VH和D基因區(qū)段與中間序列一起刪除。在這樣的操作中，刪除了內(nèi)源性ADAM6基因[1-5]。ADAM6基因編碼一種屬于A解聚素和金屬蛋白酶家族的蛋白質(zhì)。ADAM家族成員是跨膜糖蛋白，其含有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域例如pro-結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶、解聚素、富半胱氨酸、表皮生長因子(EGF)樣、跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)結(jié)構(gòu)域。在各種生物學(xué)進(jìn)展中顯示在細(xì)胞粘附中涉及ADAM家族。在小鼠中，有兩個(gè)ADAM6拷貝(ADAM6a，ADAM6b)，其位于第12染色體的IgH基因座中的VH和D基因區(qū)段之間(在小鼠VH5-1和D1-1基因區(qū)段之間的中間區(qū)中)。這兩個(gè)毗連的無內(nèi)含子ADAM6基因具有95％的核苷酸序列相同性和90％的氨基酸相同性。在人和大鼠中，只有一個(gè)ADAM6基因。小鼠ADAM6的表達(dá)模式分析顯示其專一地表達(dá)于睪丸[6]。盡管可以在淋巴細(xì)胞中檢測到ADAM6轉(zhuǎn)錄物，但限于細(xì)胞核，這提示ADAM6基因的轉(zhuǎn)錄特別地是由于從D區(qū)的轉(zhuǎn)錄通讀，而不是活性信使RNA產(chǎn)生[7]。成熟的ADAM6蛋白定位于頂體以及精子頭部較后的區(qū)上。尤其是，ADAM6與ADAM2和ADAM3形成復(fù)合體，這是小鼠中受精所需要的[8]。參考文獻(xiàn)[9]暗示模型中的ADAM6，其中ADAM6被TPST2硫酸化后與ADAM3相互作用，于是ADAM6和ADAM3從無Tpst2的精子中丟失。研究觀察到Tpst2缺陷的小鼠具有雄性不育性、精子移動(dòng)性缺陷和可能的精子-卵子膜相互作用異常。因此，保持ADAM6在精子中表達(dá)對育性是至關(guān)重要的。因此，人們認(rèn)為其中刪除了ADAM6基因的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠和大鼠不可育。這妨礙了群體的繁殖，也妨礙了利用這些小鼠作為轉(zhuǎn)基因抗體產(chǎn)生平臺(tái)。值得提供改良的可育產(chǎn)生抗體的非人轉(zhuǎn)基因脊椎動(dòng)物。參考文獻(xiàn)[1]PrimakoffP,MylesDG.TheADAMgenefamily:surfaceproteinswithadhesionandproteaseactivity.TrendsGenet.2000Feb；16(2):83-7.[2]EvansJP.FertilinbetaandotherADAMsasintegrinligands:insightsintocelladhesionandfertilization.Bioessays.2001Jul；23(7):628-39.[3]PrimakoffP,MylesDG.Penetration,adhesion,andfusioninmammaliansperm-egginteraction.Science.2002Jun21；296(5576):2183-5.[4]TalbotP,ShurBD,MylesDG.Celladhesionandfertilization:stepsinoocytetransport,sperm-zonapellucidainteractions,andsperm-eggfusion.BiolReprod.2003Jan；68(1):1-9.[5]HuovilaAPet.al.,SheddinglightonADAMmetalloproteinases.TrendsBiochemSci.2005Jul；30(7):413-22.[6].ChoiI,et.al.,CharacterizationandcomparativegenomicanalysisofintronlessAdamswithtesticulargeneexpression.Genomics.2004Apr；83(4):636-46.[7].FeatherstoneK,WoodAL,BowenAJ,CorcoranAE.ThemouseimmunoglobulinheavychainV-DintergenicsequencecontainsinsulatorsthatmayregulateorderedV(D)Jrecombination.JBiolChem.2010Mar26；285(13):9327-38.Epub2010Jan25.[8].HanC,et.al.,ComprehensiveanalysisofreproductiveADAMs:relationshipofADAM4andADAM6withanADAMcomplexrequiredforfertilizationinmice.BiolReprod.2009May；80(5):1001-8.Epub2009Jan7.[9].Marcelloetal,Lackoftyrosylproteinsulfotransferase-2activityresultsinalteredsperm-egginteractionsandlossofADAM3andADAM6inepididymalsperm,JBiolChem.2011Apr15；286(15):13060-70.Epub2011Feb21.
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了這一目的，本專利技術(shù)提供：一種制備可育的非人脊椎動(dòng)物(例如，小鼠)的方法，所述非人脊椎動(dòng)物對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，所述小鼠的基因組(a)在第12號(hào)染色體(或?qū)λ黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體)的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及(b)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；所述方法包括以下步驟：(c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到第12號(hào)染色體(或?qū)λ黾棺祫?dòng)物而言等價(jià)的染色體)的DNA中進(jìn)行，這樣人基因區(qū)段與小鼠或人內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)(任選地，Cμ和/或Cγ)的上游可操作連接；(d)與步驟(c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中刪除包括小鼠ADAM6編碼核苷酸序列；(e)與步驟(c)或(d)同時(shí)或分別進(jìn)行，將一或多個(gè)ADAM6編碼核苷酸序列插入到ES細(xì)胞基因組；以及(f)使ES細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種制備小鼠細(xì)胞或可育小鼠的方法，所述小鼠細(xì)胞或可育小鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，所述小鼠的基因組(a)在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及(b)內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；所述方法包括以下步驟：(c)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，這樣所述人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)(任選地，Cμ和/或Cγ)的上游可操作連接；(d)與步驟(c)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠ADAM6基因；(e)與步驟(c)或(d)同時(shí)或分別進(jìn)行，將一或多個(gè)ADAM6基因插入到ES細(xì)胞基因組；以及任選地(f)使ES細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的且編碼ADAM6，其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；任選地，其中所述可育小鼠或子代是雄性。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2011.12.21 GB 1122047.2;2011.12.02 US 13/310,431;21.一種制備小鼠幼崽的方法，包括使可育的雄性親代小鼠與可育的雌性親代小鼠繁殖，其中所述雄性親代小鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，并且所述雄性親代小鼠的基因組在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；并且兩個(gè)第12號(hào)染色體上都包含插入的ADAM6基因；并且其中所述雄性親代小鼠通過包括以下步驟的方法提供：(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，其中所述人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)的上游可操作連接；(b)與步驟(a)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠ADAM6基因；(c)與步驟(a)或(b)同時(shí)或分別進(jìn)行，將一或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6基因插入到所述胚胎干細(xì)胞基因組以恢復(fù)育性；以及(d)使所述胚胎干細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的且編碼ADAM6，其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；其中所述可育小鼠或子代是雄性；且其中插入可表達(dá)的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因或可表達(dá)的大鼠ADAM6基因，這樣所述可育的雄性親代小鼠可以表達(dá)ADAM6a和ADAM6b蛋白或大鼠ADAM6蛋白。2.一種制備小鼠幼崽的方法，包括使可育的雄性親代小鼠與可育的雌性親代小鼠繁殖，其中所述雄性親代小鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，并且所述雄性親代小鼠的基因組在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；并且兩個(gè)第12號(hào)染色體上都包含插入的ADAM6基因；并且其中所述雄性親代小鼠通過包括以下步驟的方法提供：(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，其中所述人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)的上游可操作連接；(b)與步驟(a)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠ADAM6基因；(c)使所述胚胎干細(xì)胞發(fā)育成為小鼠或其子代，所述小鼠或其子代基因組包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；(d)從步驟(c)的小鼠或子代獲得第二胚胎干細(xì)胞并在所述第二胚胎干細(xì)胞基因組中插入可表達(dá)的ADAM6基因以恢復(fù)育性；以及(e)使所述第二胚胎干細(xì)胞發(fā)育成為可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的并且編碼ADAM6，其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；其中所述可育小鼠或子代是雄性；且其中插入可表達(dá)的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因或可表達(dá)的大鼠ADAM6基因，這樣所述可育的雄性親代小鼠可以表達(dá)ADAM6a和ADAM6b蛋白或大鼠ADAM6蛋白。3.一種制備小鼠幼崽的方法，包括使可育的雄性親代小鼠與可育的雌性親代小鼠繁殖，其中所述雄性親代小鼠對于轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的，并且所述小鼠的基因組在第12號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；并且兩個(gè)第12號(hào)染色體上都包含插入的ADAM6基因；并且其中所述雄性親代小鼠通過包括以下步驟的方法提供：(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到第12號(hào)染色體的DNA中進(jìn)行，其中人基因區(qū)段與小鼠或人重鏈恒定區(qū)的上游可操作連接；(b)與步驟(a)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述第12號(hào)染色體的全部或部分小鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括小鼠ADAM6基因；(c)使所述胚胎干細(xì)胞發(fā)育成為小鼠或其子代，所述小鼠或其子代基因組包含所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；以及(d)通過繁殖步驟(c)的所述小鼠或子代以及另外的小鼠，所述另外的小鼠的基因組包含一或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6基因，產(chǎn)生可育小鼠或其子代，所述可育小鼠或其子代的基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的并且編碼可表達(dá)的ADAM6，其中基因組中的兩條第12號(hào)染色體的內(nèi)全部或部分源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；其中所述可育小鼠或子代是雄性；且其中插入可表達(dá)的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因或可表達(dá)的大鼠ADAM6基因，這樣所述可育的雄性親代小鼠可以表達(dá)ADAM6a和ADAM6b蛋白或大鼠ADAM6蛋白。4.一種制備大鼠幼崽的方法，包括使可育的雄性親代大鼠與可育的雌性親代大鼠繁殖，其中所述雄性親代大鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，并且所述雄性親代大鼠的基因組在大鼠第6號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；并且兩個(gè)第6號(hào)染色體上都包含插入的ADAM6基因；并且其中所述雄性親代大鼠通過包括以下步驟的方法提供：(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH基因區(qū)段、一或多個(gè)人D基因區(qū)段和一或多個(gè)人JH基因區(qū)段插入到所述染色體的DNA中進(jìn)行，其中人基因區(qū)段與大鼠重鏈恒定區(qū)的上游可操作連接；(b)與步驟(a)同時(shí)或分別進(jìn)行，刪除所述染色體的全部或部分大鼠內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)，以使內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活，其中該刪除包括ADAM6基因；(c)與步驟(a)或(b)同時(shí)或分別進(jìn)行，將一或多個(gè)可表達(dá)的ADAM6基因插入到所述胚胎干細(xì)胞基因組以恢復(fù)育性；以及(d)使所述胚胎干細(xì)胞發(fā)育成為可育大鼠或其子代，所述可育嚙齒動(dòng)物或其子代的基因組對于所述轉(zhuǎn)基因重鏈基因座而言是純合的且編碼ADAM6，其中基因組中的兩條所述染色體的全部或部分內(nèi)源性重鏈VDJ區(qū)已刪除；其中所述可育大鼠或子代是雄性；且其中插入可表達(dá)的小鼠ADAM6a和ADAM6b基因或可表達(dá)的大鼠ADAM6基因，這樣所述可育的雄性親代大鼠可以表達(dá)ADAM6a和ADAM6b蛋白或大鼠ADAM6蛋白。5.一種制備大鼠幼崽的方法，包括使可育的雄性親代大鼠與可育的雌性親代大鼠繁殖，其中所述雄性親代大鼠對于轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座而言是純合的，并且所述雄性親代大鼠的基因組在第6號(hào)染色體的各自拷貝上包含各轉(zhuǎn)基因重鏈基因座；內(nèi)源性抗體重鏈表達(dá)失活；并且兩個(gè)第6號(hào)染色體上都包含插入的ADAM6基因；并且其中所述雄性親代大鼠通過包括以下步驟的方法提供：(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎干細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)基因抗體重鏈基因座，所述構(gòu)建通過將一或多個(gè)人VH...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：G·A·弗里德里希，EC·李，
申請(專利權(quán))人：科馬布有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：英國;GB