本發明專利技術公開一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，所述試劑盒包含25aa多肽抗原，該25aa多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發明專利技術PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，以PRRSV基因標記疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)特異性標記區域缺失的25aa多肽作為包被抗原，具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，可快速、準確地區分傳統PRRS疫苗免疫與標記疫苗免疫豬的血清抗體，同時可快速、準確地鑒別診斷出PRRSV基因標記疫苗株與自然感染毒株，對于PRRS基因標記疫苗株的臨床廣泛應用具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，所述試劑盒包含25aa多肽抗原，該25aa多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本專利技術PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，以PRRSV基因標記疫苗株(rHN4-Δ25+NP49株)特異性標記區域缺失的25aa多肽作為包被抗原，具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，可快速、準確地區分傳統PRRS疫苗免疫與標記疫苗免疫豬的血清抗體，同時可快速、準確地鑒別診斷出PRRSV基因標記疫苗株與自然感染毒株，對于PRRS基因標記疫苗株的臨床廣泛應用具有重要意義。【專利說明】PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒及方法和應用
本專利技術涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)檢測
，具體涉及一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒及方法和應用。
技術介紹
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的全球范圍內嚴重危害養豬業的傳染病。1987年首先在美國發現該病，以各年齡段母豬繁殖障礙和呼吸疾病為特征癥狀的傳染性疾病在美國和加拿大地區發現，并迅速向世界各地蔓延；1996年我國首次分離出PRRSV，2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合(HP-PRRS)大范圍爆發，給我國養殖業帶來巨大損失，PRRS的監測和防控成為重要課題。目前，豬繁殖與呼吸綜合征流行毒株包括PRRS經典毒株、PRRS經典疫苗株、PRRS高致病性毒株、PRRS高致病性疫苗株等，眾多毒株并存使我們對該病監測的難度加大。該病的流行特點及其病原特性決定其高度傳染性，疫苗是目前預防該病的主要手段。國內使用的疫苗主要包括弱毒疫苗和滅活疫苗，其中弱毒疫苗由于其具有抗體產生快、持續時間長和保護力強等特點，在臨床上被廣泛使用于控制PRRS的流行，但傳統的弱毒疫苗在抗體監測過程中無法區分野毒和疫苗毒感染。基于此，本實驗室在PRRSV弱毒疫苗HuM-Fl 12株反向遺傳平臺的基礎上，將NSP2的復制非必須區域(Λ 508-532)進行缺失，同時在該區域插入新城疫病毒NP蛋白末端49個氨基酸(ΝΡ49)作為標記，成功構建了雙標記基因工程弱毒疫苗株(rHN4- Δ 25+NP49株)，該疫苗株由于具備缺失和插入正、負雙標記，這就為特異性區分野毒感染和實現PRRS有效防控奠定了堅實基礎。
技術實現思路
本專利技術要解決目前由于眾多種類PRRS疫苗的廣泛使用，加大了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染鑒別診斷難度的技術問題，提供一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，該試劑盒以基因工程標記疫苗株(rHN4-A25+NP49株)的特征缺失的25個氨基酸(25aa)作為包被抗原，不僅能有效區分傳統PRRS疫苗免疫與標記疫苗免疫豬的血清抗體，而且能有效區分出PRRSV基因標記疫苗株與自然感染毒株，其靈敏度高、特異性強、重復性好。 為了解決上述技術問題，本專利技術通過如下技術方案實現: 在本專利技術的一個方面，提供了一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，所述試劑盒包含25aa多肽抗原，該25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 本專利技術采用特異性標記區域缺失的25個氨基酸(25aa)多肽作為包被抗原，保證抗原的特異性和純度，避免了其他雜蛋白混雜存在干擾。而且25aa相對分子量小、結構簡單，降低了與其他病毒細菌抗體交叉反應的可能性，該25aa合成肽抗原呈水溶性，可較好的包被于酶標板，操作省時方便。該25aa特異性多肽抗原不同于PRRSV全病毒抗原或高表達量的融合蛋白抗原，由于PRRSV感染豬產生的抗體大部分是針對N蛋白，血清樣品中針對25aa多肽抗原的抗體相對較少，因此選擇純度高的25aa多肽作為包被抗原可以明顯提高針對25aa抗體檢測的敏感度和特異性。 所述試劑盒還包含ELISA酶標板、封閉液、血清稀釋液、酶標二抗、顯示液、終止液、標準陽性血清、標準陰性血清。 優選的，25aa多肽抗原的包被濃度為500ng/孔。 優選的，所述封閉液為5%重量濃度的脫脂乳。 優選的，所述血清稀釋液為2%重量濃度的牛血清白蛋白；所述血清稀釋液對血清的稀釋度為1: 40。 優選的，所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗豬抗體，其稀釋度為I: 8000。 在本專利技術的另一方面，還提供了一種非診斷目的的PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別方法，包括以下步驟: 用25aa多肽抗原包被ELISA酶標板，該25aa多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； 將待測血清與包被抗原作用后，依次加入酶標二抗、顯色液和終止液； 利用酶標儀讀取吸光度值0D45(lnm，并按公式:S/P =(待測血清樣品OD-陰性對照0D) / (陽性對照OD-陰性對照0D)，計算待測血清樣品的S/P值； 待測血清樣品S/P值>臨界值的判為陽性，5外值<臨界值的判為陰性，所述臨界值是通過ROC統計學分析方法獲得的當靈敏度和特異度數值之和最大時對應的S/P值。 所述待測血清的稀釋度為1: 40。 在本專利技術的另一方面，還提供了上述試劑盒在制備鑒別診斷PRRS基因工程標記疫苗免疫豬的產品中的應用。 本專利技術PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，以基因工程標記疫苗株(rHN4-A25+NP49株)的特征缺失的25個氨基酸(25aa)作為包被抗原，具有特異性強、靈敏度高、重復性好的特點，可快速、準確地區分傳統PRRS疫苗免疫與標記疫苗免疫豬的血清抗體，同時可快速、準確地鑒別診斷出PRRSV基因標記疫苗株與自然感染毒株，對于PRRS基因標記疫苗株的臨床廣泛應用具有重要意義。 【專利附圖】【附圖說明】 下面結合附圖和【具體實施方式】對本專利技術作進一步詳細的說明。 圖1是本專利技術實施例2的25aa_ELISA反應條件優化結果圖； 圖2是本專利技術實施例3的25aa_ELISAROC曲線圖； 圖3是本專利技術實施例6的25aa_ELISA檢測HuN4_F112血清樣品結果圖。 【具體實施方式】 下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克J，拉塞爾DW，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.分子克隆實驗指南，第3版，北京:科學出版社，2002)中所述的方法進行。 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) rHN4- Δ 25+NP49株是一種用于預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的新型基因標記弱毒疫苗候選株，為了配合該基因標記疫苗株的免疫效果評價，本專利技術以基因工程標記疫苗株(rHN4-A25+NP49株)的特征缺失的25個氨基酸(25aa，SEQ ID NO: I)作為包被抗原，建立一種簡便、特異的25aa_ELISA方法。本專利技術通過對25aa-ELISA反應條件的優化，確定抗原最適包被濃度為500ng/孔，5 %脫脂乳4°C過夜封閉，血清最佳稀釋度為1: 40，酶標二抗最佳稀釋度為1: 8000，抗體最佳作用時間及底物選擇和顯色條件和時間等，同時確定其陰陽性臨界值S/P判定標準為0.15，批內和批間重復實驗結果顯示其變異系數均低于10%，表明該方法具有良好的重復本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種PRRSV基因標記疫苗株ELISA鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含25aa多肽抗原，該25aa多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：童光志，周艷君，孫晶，姜一峰，童武，
申請(專利權)人：中國農業科學院上海獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：上海;31
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