從乳汁中分離和培養奶牛乳腺上皮細胞的方法及專用培養基技術

本發明專利技術公開了一種從乳汁中分離和培養奶牛乳腺上皮細胞的方法及專用培養基。本發明專利技術公開一種從牛乳汁中分離和培養乳腺上皮細胞的方法，包括如下步驟：選擇牛乳汁中體細胞數低于5×104個/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養牛乳汁中的乳腺上皮細胞。本發明專利技術公開的方法通過奶牛生產記錄限定適宜乳汁采樣牛只的條件以及確定收集期為泌乳中后期，通過人工擠奶方法，簡便、快速，經濟的獲得牛奶樣品，并分離、培養乳腺上皮細胞，結果可靠、穩定，操作簡單，適合常規實驗室實驗需要，成本低、細胞狀態好，同時與組織塊培養法相比，僅需獲得牛乳樣品，對牛只沒有損傷，操作簡單，適用范圍更廣。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種從乳汁中分離和培養奶牛乳腺上皮細胞的方法及專用培養基，屬于生物

技術介紹
乳房是母畜特有的哺育器官，泌乳期乳腺內充滿豐富的腺泡和導管(崔立莉，2006)。乳腺是由外層肌上皮和內層分泌上皮細胞圍成的球形結構，與導管相連，其中分泌上皮是腺泡內合成乳成分的基本單元，是其行使泌乳功能的基礎。因此，它是研究乳成分合成和變動機制、乳腺發育和變化以及乳腺腫瘤形成、癌變的相關因子和基因的不可或缺的實驗材料(杜鵑等，2007)。 目前，乳腺上皮細胞的培養歷史已有100多年，作為一種高度分化的成體細胞，其在離體培養一段時間后往往出現形態和特性的脫分化，趨向變為成纖維樣的狀態(Ebner等，1961)。有限二倍體細胞由于脫離正常的體內環境，原代培養后逐漸脫分化的現象是很常見的。面對這種問題，研究人員用基因轉移技術將SV40、原癌基因和人端粒酶逆轉錄酶基因等外源基因整合到有限細胞內，可獲得永生性的轉化細胞(陶謙等，2001)。永生性細胞在保持著部分與起源細胞相似的生物特性和表型的同時，也表現出一些轉化和純化培養后的新特點。外源基因隨機整合到宿主細胞基因組的位置不確定，其插入位點可能影響到細胞原有基因的功能，克隆細胞由于缺少細胞互作的影響也表現出新的特征。已有的永生化乳腺上皮細胞系對因子刺激的反應和乳成分的表達存在差異，這些不確定性使其應用受到限制。 由于永生化細胞的諸多不確定性，原代細胞系更能代表體內的器官特異性功能和信號轉導途徑。一般體外培養的乳腺上皮細胞可以穩定培養幾個月，能滿足細胞實驗周期的需要。因此，多數生物學實驗還是首選原代培養的乳腺上皮細胞(Pantsckenko等，2000)。原代細胞經過多次傳代后丟掉一些原始的受限制的特性，在生長率、乳汁合成、對因子刺激的反應和敏感性上與體內細胞存在差異。不過，這個問題可以通過低溫貯存新鮮分離的細胞來解決，對培養細胞運用冷凍解凍技術(Bramley等，1982)，以保持其原有細胞特性，讓符合研究需求的原代細胞和傳代細胞能夠得到長久保存，使在不同實驗條件下分析同一原始特性細胞的特征成為可能。同時，可通過添加一些生物活性因子(胰島素，氫化可的松，表皮生長因子，轉鐵蛋白等)促進細胞增殖和維持細胞特性，延緩細胞脫分化。 目前國內培養原代乳腺上皮細胞通常采用的方法為組織塊培養法，這種方法通過活體穿刺或屠宰獲得活體組織，一方面對牛體的損害較大、購買健康成體牛的成本高；另一方面，多獲得的是淘汰牛的活體組織，難以獲得高產牛的組織樣品。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種從乳汁中分離和培養奶牛乳腺上皮細胞的方法及專用培養基。 本專利技術提供一種從牛乳汁中分離和培養乳腺上皮細胞的方法，包括如下步驟：選擇牛乳汁中體細胞數低于5×104個/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養牛乳汁中的乳腺上皮細胞； 所述泌乳中后期為產犢后150-250d； 所述采集牛乳汁時前50-100ml牛乳汁不收集。 上述方法中，所述分離并培養牛乳汁中的乳腺上皮細胞包括分離并培養原代牛乳腺上皮細胞，再將原代牛乳腺上皮細胞進行傳代培養，得到傳代的牛乳腺上皮細胞。 上述任一所述的方法中，所述原代牛乳腺上皮細胞和傳代的牛乳腺上皮細胞培養時使用的培養基按照如下方法制備：將DMEM/DF12培養基和FBS按照體積比為9：1混勻，加入終濃度為1×的青霉素，終濃度為1×的鏈霉素，終濃度為5ug/mL的胰島素，終濃度為5ug/mL的轉鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可的松，終濃度為10ng/mL的表皮生長因子，終濃度為1ug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL的重組牛胎盤催乳素； 所述DMEM/DF12培養基購自Gibco，產品目錄號為C11330500BT； 所述終濃度為1×的青霉素和終濃度為1×的鏈霉素的母液是濃度為100×的青霉素/鏈霉素雙抗溶液； 所述濃度為100×的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100×)，購自Gibco，產品目錄號為15140-122； 所述重組牛胎盤催乳素購自Prospec，產品目錄號為CYT-511。 上述任一所述的方法中，所述牛為奶牛。 上述任一所述的方法中，所述奶牛為荷斯坦牛。 一種培養基也屬于本專利技術的保護范圍，按照如下方法制備：將DMEM/DF12培養基和FBS按照體積比為9：1混勻，加入終濃度為1×的青霉素,終濃度為1×的鏈霉素，終濃度為5ug/mL的胰島素，終濃度為5ug/mL的轉鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可的松，終濃度為10ng/mL的表皮生長因子，終濃度為1ug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL的重組牛胎盤催乳素； 所述DMEM/DF12培養基購自Gibco，產品目錄號為C11330500BT； 所述終濃度為1×的青霉素和終濃度為1×的鏈霉素的母液是濃度為100×的青霉素/鏈霉素雙抗溶液； 所述濃度為100×的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100×)，購自Gibco，產品目錄號為15140-122； 所述重組牛胎盤催乳素購自Prospec，產品目錄號為CYT-511。 本專利技術提供的方法通過奶牛生產記錄限定適宜乳汁采樣牛只的條件以及確定收集期為泌乳中后期，通過人工擠奶的方法，簡便、快速，經濟的獲得牛奶樣品，并分離、培養乳腺上皮細胞，結果可靠、穩定，操作簡單，適合常規實驗室實驗需要，成本低、獲得的細胞狀態好。本專利技術的方法與組織塊培養法相比，僅需獲得牛乳樣品，對牛只沒有損傷，操作簡單，適用范圍更廣。 附圖說明 圖1為從乳汁中分離的原代乳腺上皮細胞的形態。 圖2為牛乳腺上皮細胞生長曲線。 圖3為乳腺上皮細胞的角蛋白18染色結果。 圖4為乳腺上皮細胞內乳成分相關基因的RT-PCR檢測結果。 具體實施方式 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。 DMEM/DF12培養基購自Gibco，產品目錄號為C1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從牛乳汁中分離和培養乳腺上皮細胞的方法，包括如下步驟：選擇牛乳汁中體細胞數低于5×104個/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養牛乳汁中的乳腺上皮細胞。

【技術特征摘要】
1.一種從牛乳汁中分離和培養乳腺上皮細胞的方法，包括如下步驟：選擇牛乳汁
中體細胞數低于5×104個/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養牛
乳汁中的乳腺上皮細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述分離并培養牛乳汁中的乳腺上
皮細胞包括分離并培養原代牛乳腺上皮細胞，再將原代牛乳腺上皮細胞進行傳代培養，
得到傳代的牛乳腺上皮細胞。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述原代牛乳腺上皮細胞和傳
代的牛乳腺上皮細胞培養時使用的培養基按照如下方法制備：將DMEM/DF12培養基和
FBS按照體積比為9：1混勻，加入終濃度為1×的青霉素，終濃度為1×的鏈霉素，
終濃度為5ug/mL的胰島素，終濃度為5ug/mL的轉鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可
的松，終濃度為10ng/mL的表皮生長因子，終濃度為1ug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL
的重組牛胎盤催乳素；
所述DMEM/DF12培養基購自Gibco，產品目錄號為C11330500BT；
所述終濃度為1×的青霉素和終濃度為1×的鏈霉素的母液是濃度為100×的青霉
素/鏈霉素雙抗溶液；
所述濃度為100×的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫東曉，謝巖，楊少華，崔曉鋼，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11