一種熒光核酸銀及其制備方法和應用技術

本發明專利技術屬于金屬離子檢測和核酸試劑制備領域，特指一種熒光納米核酸-銀簇及其制備方法及其運用。本發明專利技術以小分子核酸為模版，合成了一種新型熒光DNA納米銀簇；納米銀簇的大小為2～4nm；它的水溶液顯示淡黃色，用600nm紅光激發，660nm處有較強的熒光發射，熒光量子產率為0.2（以聯吡啶釕為對照），其660nm處的熒光能被三價和二價鐵離子淬滅，該DNA-AgNCs的熒光對于二價鐵和三價鐵離子有明顯不同的熒光感應，對二價鐵的靈敏度遠遠高于三價鐵，因此，可用于定性和定量分析三價和二價鐵的總量以及低濃度二價鐵（10-9～10-5μM）和三價鐵（10-6～10-1μM）的定性分析。

【技術實現步驟摘要】
一種熒光核酸銀及其制備方法和應用
本專利技術屬于金屬離子檢測和核酸試劑制備領域，特指一種熒光納米核酸-銀簇及其制備方法及其在用熒光光譜法快速檢測溶液中二價和三價鐵含量的運用。
技術介紹
近年來，使用人工合成的探針選擇性地感應和識別環境中以及生物體系統中重要的離子特別是重金屬離子引起了人們極大的興趣；鐵離子在工業生產上廣泛使用，同時它也是人體必需的微量元素之一，鐵參與氧的運輸與儲存，還可以促進發育；增加對疾病的抵抗力；調節組織呼吸，防止疲勞；構成血紅素，預防和治療因缺鐵而引起的貧血；使皮膚恢復良好的血色；鐵(鐵食品)雖然是人體必需的微量元素(微量元素食品)，鐵本身也不具有毒性，但當攝入過量或誤服過量的鐵制劑時也可能導致鐵中毒、心臟和肝臟疾病、糖尿病等，所以，在環境中以及生物體系統中簡便并快速檢測鐵離子就顯得尤為重要；近年來分光光度法被報道用于溶液中鐵離子的檢測[王愛榮,谷永慶,王少冷.微量鐵的分光光度測定概述[J].廣東微量元素科學,2005,12(9):5-10]，但這些方法難以精確測量細胞中的金屬離子且不能很好地區分二價鐵離子和三價鐵離子；熒光探針在生物和環境檢測中有著廣泛的應用,熒光探針的高靈敏性、高選擇性使它成為化學分析中不可缺少的手段；以DNA為模板的銀納米簇因其良好的生物兼容性和較低的毒性而逐漸興起[ZhaoTT,ChenQY,ZengC,LanYQ,CaiJG.Multi-DNA–Agnanoclusters:reassemblymechanismandsensingthechangeofHIFincells[J].J.Mater.Chem.B,2013,1(36):4678-4683.;OblioscaJM,LiuC,YehHC.FluorescentsilvernanoclustersasDNAprobes[J].Nanoscale,2013,5(18):8443-8461.]；熒光核酸銀納米團簇與特殊目標物質相互作用會引起熒光強度的改變，這為鐵離子的定性和定量檢測提供了一個新的思路，核酸銀用于三價和二價鐵離子的區別國際上未見報道，我們的研究將為生物體內鐵離子種類的快速鑒別提供新的方法。
技術實現思路
我們以一種序列為5’-CCCTCCCTTCCCTCCCCGGGCCAAGAGTGTGCTAAA-3’的小分子核酸（DNA)為模版，上述核酸購自上海生工生物工程有限公司，合成了一種新型熒光DNA納米銀簇（標記為DNA-AgNCs)；納米銀簇的大小為2~4nm；它的水溶液顯示淡黃色，用600nm紅光激發，660nm處有較強的熒光發射，熒光量子產率為0.2（以聯吡啶釕為對照），其660nm處的熒光能被三價和二價鐵離子淬滅（參見附圖2），說明該核酸納米銀簇（DNA-AgNCs）是一種靈敏的熒光探針，由圖2可見該DNA-AgNCs的熒光對于二價鐵和三價鐵離子有明顯不同的熒光感應，對二價鐵的靈敏度遠遠高于三價鐵，因此，可用于定性和定量分析三價和二價鐵的總量以及低濃度二價鐵（10-9~10-5μM）和三價鐵（10-6~10-1μM）的定性分析。新型熒光DNA納米銀簇（DNA-AgNCs)的合成反應過程如下：將DNA和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液（pH5，10mM）中，DNA與Ag+的濃度分別為6.4μM和100~200μM（最佳為200μM）；將混合溶液轉到水浴加熱，溫度升到70~80℃（最佳為DNA的Tm值75℃）后穩定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫過程為3.5-6小時，最佳為3.5小時；最后在上述溶液中以摩爾比BH4-:Ag+=1:1~2:1（最佳為2:1）加入NaBH4（10mM）溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉到4℃避光保存24-40小時，最佳36小時；用600nm紅光激發，測660nm處發射，即可得到穩定的熒光探針。反應液的最終體積為1ml。本專利技術的優點：本專利技術基于轉鐵蛋白識別基因設計鐵離子敏感性新型熒光核酸銀簇，結果表明制備的核酸銀探針能夠很好地檢驗鐵離子，且對于二價鐵離子和三價鐵離子有明顯不同的響應，0.5μM的DNA-AgNCs水溶液對于Fe3+的感應可低至10-6μM，對Fe2+感應可低至10-9μM，因此可用于低濃度條件下二價鐵離子（10-9~10-5μM）和三價鐵離子（10-6~10-1μM）的定性分析（見圖3，圖1）；由于二價和三價鐵離子的表現不同的生理功能，對二價鐵和三價鐵不同感應的熒光探針，可望用于二價鐵離子反應迅速，現象明顯的快速檢測系統；本專利技術是國際上首次基于轉鐵蛋白識別基因的原理，將這種微觀結合信號放大為宏觀熒光變化，來實現金屬鐵離子的探測，是一種簡便，直觀、經濟的分析方法，該方法也為基于核酸高識別原理發展新型分析試劑提供了理論上和技術上的支撐。附圖說明圖1為DNA-AgNCs(0.5μM)的水溶液隨著硝酸鐵的加入熒光變化圖，λex=600nm；其中Fe(NO3)3濃度為a-i:0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、5*10-2、10-1、5*10-1μM。圖2為DNA-AgNCs(2μM)水溶液加入0.1μMFeCl3(1)、Fe(NO3)3(2)、(NH4)2Fe(SO4)2(3)后的熒光淬滅圖。圖3為DNA-AgNCs(0.5μM)的水溶液隨著(NH4)2Fe(SO4)2的加入熒光變化圖，λex=600nm；其中(NH4)2Fe(SO4)2濃度為a-f:0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5μM。圖4為熒光強度與(NH4)2Fe(SO4)2濃度的關系圖，a-f:0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5μM。圖5為熒光強度與Fe(NO3)3濃度的關系圖，a-i:0、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、5*10-2、10-1、5*10-1μM。具體實施方式、試劑和原料反應中所用的溶劑皆為分析純，所用試劑未加特殊說明直接應用而未經任何特殊處理；一水合檸檬酸鈉，六水合硫酸亞鐵銨，九水合硝酸鐵，氫氧化鈉，硼氫化鈉（粉末，96%），硝酸銀（99%，A.C.S.）購于國藥集團化學試劑有限公司，DNA序列（上海生工生物工程有限公司）。紫外可見分光光度儀（日本島津UV-2450型），190-800nm；CarryEclipse熒光分光光度計（美國瓦里安有限公司）；JEM-200CX型透射電鏡（日本電子株式會社）；Jasco-810圓二色譜儀(日本分光公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干箱（上海-恒科技有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海-恒科技有限公司）；TopPette手動單道可調式移液槍（20-200μl）；PHS-3C酸度計（上海第二分析儀器廠）；恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)。化合物的合成方法：實施例1（最佳合成條件）：將DNA和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液（pH5，10mM）中，DNA與Ag+的濃度分別為6.4和200μM。將混合溶液轉到水浴加熱，溫度升到DNA的Tm值（75℃）后穩定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫過程為3.5小時，最后在上述溶液中以摩爾比BH4-:Ag+=2:1加入NaBH4（10mM）溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉到4℃避光保存36小時，反應液的最終本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種小分子核酸，其特征在于：其序列為5’?CCC?TCC?CTT?CCC?TCC?CCG?GGC?CAA?GAG?TGT?GCT?AAA?3’。

【技術特征摘要】
1.一種小分子核酸，其特征在于：其序列為5’-CCCTCCCTTCCCTCCCCGGGCCAAGAGTGTGCTAAA-3’。2.一種熒光核酸銀的制備方法，所述熒光核酸銀的大小為2～4nm；它的水溶液顯示淡黃色，用600nm紅光激發，660nm處有較強的熒光發射，以聯吡啶釕為對照熒光量子產率為0.2，其660nm處的熒光能被三價和二價鐵離子淬滅，其特征在于制備方法按照下述步驟進行：以5’-CCCTCCCTTCCCTCCCCGGGCCAAGAGTGTGCTAAA-3’的小分子核酸為模版，將小分子核酸和AgNO3溶液混合于檸檬酸鈉緩沖液中；將混合溶液轉到水浴加熱，溫度升到70～80℃后穩定三分鐘，緩慢降溫到室溫，降溫時間為3.5-6小時；最后在上述溶液中以摩爾比BH4-:Ag+＝1:1～2:1加入NaBH4溶液，混勻于室溫避光保存10分鐘后轉到4℃避光保存24-40小時；即可得到穩定的熒光探針；所述檸檬...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳秋云，陳甜甜，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32