BLyS拮抗肽SS12、含該拮抗肽的融合蛋白SS12-Fc及基因制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了BLyS拮抗肽SS12、含該拮抗肽的融合蛋白SS12-Fc及基因，實驗證明SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白可以和BLyS結(jié)合，并且抑制BLyS與BCMA、BLyS與TACI的相互作用。SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白既保障了SS12和3SS12空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，又不削弱肽的活性。同時SS12和3SS12得到Fc標(biāo)簽，更易于純化與檢測。因此，SS12-Fc和3SS12-Fc可以作為治療BLyS拮抗劑應(yīng)用于自身免疫疾病和淋巴瘤的潛在藥物。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
BLyS拮抗肽SS12、含該拮抗肽的融合蛋白SS12-Fc及基因
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及BLyS拮抗肽，以及含BLyS拮抗肽的融合蛋白及基因及質(zhì)粒。
技術(shù)介紹
B淋巴細(xì)胞刺激因子(Blymphocytestimulator,BLyS)，又稱為B細(xì)胞激活因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily,BAFF)，是TNF家族中的一員。由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞持續(xù)合成、分泌。BLyS能夠結(jié)合B細(xì)胞表面的三種受體，B細(xì)胞成熟抗原(Bcellmatureantigen,BCMA)，跨膜激活物和CAML結(jié)合物(TransmembraneactivatorandCAML-interactor,TACI)以及BLyS受體3(BR3)。受體結(jié)合BLyS后，偶聯(lián)TNF受體相關(guān)因子(TNFreceptorassociatedfactor,TRAF)，激活NF-ΚB途徑。最終，誘導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡基因：Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)，減少成熟B細(xì)胞的凋亡。如果敲除BLyS，小鼠體內(nèi)的成熟B細(xì)胞完全缺失。因此，BLyS在B細(xì)胞的發(fā)育和成熟過程中起至關(guān)重要的作用。由于BLyS在B淋巴細(xì)胞活化、增殖中發(fā)揮重要作用，而B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體所介導(dǎo)的體液免疫在眾多已發(fā)現(xiàn)的自身免疫性疾病當(dāng)中處于中心地位。因此，目前認(rèn)為BLyS在體內(nèi)的過量表達(dá)與某些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、口眼干燥綜合征(Siogren)等病程的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。過量表達(dá)BLyS的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣癥狀。臨床實驗也發(fā)現(xiàn)，SLE和Siogren綜合征病人的血清中，可溶性BLyS明顯高于正常人。同時，作為B細(xì)胞刺激、存活因子，BLyS及其受體參與骨髓瘤和淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，以阻斷BLyS生物學(xué)功能為策略，探討B(tài)LyS拮抗劑治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病和B細(xì)胞腫瘤疾病的研究正在國外如火如荼的進(jìn)行中。目前，針對BLyS的抑制劑的研究主要集中在研制具有中和BLyS作用的BLyS誘餌受體(decoyreceptor)、抗BLyS抗體和拮抗肽(1，2)。2011年3月美國FDA批準(zhǔn)由人類基因科學(xué)公司(HumanGenomeSciences)和葛蘭士-史克(GlaxoSmithKline)公司聯(lián)合研發(fā)的抗BLyS抗體BENLYSTA(Belimumab)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡。這是50年來，F(xiàn)DA首次批準(zhǔn)治療該類疾病的藥物。因此，BLyS拮抗劑有著廣泛的臨床應(yīng)用前景。眾多研究已經(jīng)詳細(xì)闡述BLyS與受體相互作用的可能模式及關(guān)鍵氨基酸。所以，針對BLyS與其受體結(jié)合核心區(qū)域的拮抗肽也成為BLyS抑制劑的策略。與抗體和誘餌蛋白等大分子拮抗劑相比，多肽具有分子量小、滲透性強(qiáng)、人工合成簡單、免疫原性低，毒性低和副作用少的優(yōu)點。然而，多肽也存在不穩(wěn)定、效率低和半衰期短的缺點。我們在前期工作中探討了BLyS拮抗肽抑制BLyS的功能，初步結(jié)果顯示：合成的16個氨基酸的肽在體外能夠部分抑制BLyS的作用(3)。進(jìn)一步通過計算機(jī)分子模建、優(yōu)化設(shè)計BLyS拮抗肽，將有望提高其抑制BLyS生物學(xué)功能。為開發(fā)治療SLE和RA這類自身免疫性疾病和B細(xì)胞腫瘤的新藥奠定實驗研究基礎(chǔ)。1.SunJ(孫劍),LinZ,FengJ,LiYandShenB(2008)BAFF-targetingtherapy,apromisingstrategyfortreatingautoimmunediseases.EurJPharmacol597:1–5.2.SunJ(孫劍),LinZ,FengJ,LiYandShenB(2008)Blymphocytestimulator,anewtargetfortreatingBcellmalignancies.ChineseMedicalJ121(14):1319-1323.3.SunJ(孫劍),FengJ,LiYandShenB(2006)AnovelBLySantagonistpeptidedesignedbasedonthe3-DcomplexstructureofBCMAandBLyS.BiochemBiophysResCommun346(4):1158-1162.
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種BLyS拮抗肽SS12。本專利技術(shù)的第二個目的是提供一種BLyS拮抗肽3SS12。本專利技術(shù)的第三個目的是提供一種含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-Fc。本專利技術(shù)的第四個目的是提供一種含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-Fc。本專利技術(shù)的第五個目的是提供一種編碼BLyS拮抗肽SS12的基因。本專利技術(shù)的第六個目的是提供一種編碼融合蛋白SS12-Fc的基因。本專利技術(shù)的第七個目的是提供一種含編碼融合蛋白SS12-Fc基因的質(zhì)粒。本專利技術(shù)的第八個目的是提供一種編碼BLyS拮抗肽3SS12的基因。本專利技術(shù)的第九個目的是提供一種編碼融合蛋白3SS12-Fc的基因。本專利技術(shù)的第十個目的是提供一種含編碼融合蛋白3SS12-Fc基因的質(zhì)粒。本專利技術(shù)的技術(shù)方案概述如下：BLyS拮抗肽SS12，是用SEQIDNO.1所示。BLyS拮抗肽3SS12，是用SEQIDNO.2所示。含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-Fc，是用SEQIDNO.3所示。含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-Fc，是用SEQIDNO.4所示。編碼BLyS拮抗肽SS12的基因，是用下述方法構(gòu)建：以SEQIDNO.5所示序列為上游引物，以SEQIDNO.6所示序列為下游引物，上、下游引物互補(bǔ)，通過變性、退火，配對形成編碼BLyS拮抗肽SS12的基因，所述編碼BLyS拮抗肽SS12的基因如SEQIDNO.7所示。編碼融合蛋白SS12-Fc的基因，是用下述方法構(gòu)建，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切人IgG1FcDNA片段，回收630bp的FcDNA片段，與權(quán)利要求5獲得的編碼BLyS拮抗肽SS12的基因連接，得到編碼融合蛋白SS12-Fc的基因，所述編碼融合蛋白SS12-Fc的基因如SEQIDNO.8所示。含編碼融合蛋白SS12-Fc基因的質(zhì)粒，是用下述方法構(gòu)建，用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII酶切載體pET30a，回收酶切后pET30a片段，與權(quán)利要求6獲得的編碼融合蛋白SS12-Fc的基因加入T4連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)制成含編碼融合蛋白SS12-Fc基因的質(zhì)粒SS12-Fc-pET30a。編碼BLyS拮抗肽3SS12的基因，是用下述方法構(gòu)建：含有編碼BLyS拮抗肽3SS12的基因的質(zhì)粒3SS12-pUC19(由鼎國生物技術(shù)公司合成)，用NdeI和EcoRI酶切獲得編碼BLyS拮抗肽3SS12的基因，所述編碼BLyS拮抗肽3SS12的基因如SEQIDNO.9所示。編碼融合蛋白3SS12-Fc的基因，是用下述方法構(gòu)建，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切人IgG1FcDNA片段，回收630bp的FcDNA片段，與權(quán)利要求8獲得的編碼BLyS拮抗肽3SS12的基因連接，得到編碼融合蛋白3SS12-Fc的基因，所述編碼融合蛋白3SS12-Fc的基因如SEQ本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
BLyS拮抗肽SS12，是用SEQ?ID?NO.1所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.BLyS拮抗肽SS12，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.BLyS拮抗肽3SS12，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-Fc，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。4.含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-Fc，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。5.編碼BLyS拮抗肽SS12的基因，其特征是用下述方法構(gòu)建：以SEQIDNO.5所示序列為上游引物，以SEQIDNO.6所示序列為下游引物，上、下游引物互補(bǔ)，通過變性、退火，配對形成編碼BLyS拮抗肽SS12的基因，所述編碼BLyS拮抗肽SS12的基因如SEQIDNO.7所示。6.編碼融合蛋白SS12-Fc的基因，其特征是用下述方法構(gòu)建，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII酶切人IgG1FcDNA片段，回收630bp的FcDNA片段，與權(quán)利要求5獲得的編碼BLyS拮抗肽SS12的基因連接，得到編碼融合蛋白SS12-Fc的基因，所述編碼融合蛋白SS12-Fc的基因如SEQIDNO.8所示。7.含編碼融合蛋白SS12-Fc基因的質(zhì)粒，其特征是用下述方法構(gòu)建，用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII酶切載體pET...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫劍，馮建男，臧孟存，沈倍奮，
申請(專利權(quán))人：天津大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12