用于合成錯誤最小化核酸分子的材料和方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了可用于對核酸分子進(jìn)行糾錯的材料和方法。通過暴露于具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的分子來使具有核苷酸錯配的第一多個雙鏈核酸分子片段化，留下在所述分子的末端或近末端具有錯配的雙鏈核酸分子。然后將所述核酸分子暴露于具有單向外切核酸酶活性的分子以去除所述錯配核苷酸。然后通過例如具有DNA聚合酶活性的分子的作用填充所述缺失的核苷酸。結(jié)果是雙鏈核酸分子的核苷酸錯配頻率降低。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了編碼錯配內(nèi)切核酸酶的新穎核酸序列、由此編碼的多肽以及核酸構(gòu)建體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及其各種組合物。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】用于合成錯誤最小化核酸分子的材料和方法本申請要求2012年2月1日提交的美國臨時申請序列號61/593,813的權(quán)益，其據(jù)此通過引用整體并入，包括所有表格、附圖和權(quán)利要求。專利
本專利技術(shù)總體涉及分子生物學(xué)和遺傳學(xué)，并且涉及基因和其它核酸分子的合成。序列表的并入所附序列表中的材料據(jù)此通過引用并入本申請中。名稱為SGI-XXX.XXPCT_序列表的所附序列表文本文件于當(dāng)日創(chuàng)建并且為XXKB。可在使用WindowsOS的電腦上用MicrosoftWord評估所述文件。專利技術(shù)背景在現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程中，許多涉及使用核酸分子的分子技術(shù)往往需要通過合成法生成大量核酸分子。例如，要測試代謝工程或基因組學(xué)領(lǐng)域的假說，合成指定蛋白質(zhì)和具有定制基因組的生物，往往需要有成本效益的合成對預(yù)定核苷酸序列高度保真的核酸分子的方法。核酸合成，例如雙鏈DNA合成的常見方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法。通常，如果不是必須，則確保合成DNA分子含有正確的核苷酸序列對于要使用合成DNA的分子技術(shù)的成功很重要。例如，合成用于功能多肽的基因表達(dá)的DNA編碼序列需要精確的DNA序列；因為即使一個核苷酸取代、插入或缺失也可對最終生成的多肽造成重大后果。因此，普遍認(rèn)為從合成DNA群體中將具有不正確的DNA序列的DNA分子減到最少在提供通過基因從頭合成法生成無錯合成DNA中必不可少。最近，在控制成本的同時準(zhǔn)確合成核酸分子的努力已經(jīng)取得了包括基于微芯片的基因合成和基于PCR的基因組裝技術(shù)在內(nèi)的方法。雖然這些傳統(tǒng)技術(shù)提供了合成多個基因的能力，但是減少引入所需基因序列中的錯誤仍充滿挑戰(zhàn)。為避免基因合成中固有的序列錯誤問題，一些人集中于純化在合成方法早期使用的寡核苷酸。然而，這些寡核苷酸純化方法成本高，而序列錯誤依然存在并且在合成方法的后續(xù)步驟中傳播。因此，需要減少DNA分子群體中的序列錯誤的替代方法。所期望的是以更高的具有所需核苷酸序列的分子產(chǎn)量，合成基因和其它核酸分子的途徑?？稍诤铣煞椒ǖ妮^晚步驟糾正序列錯誤的方法在核苷酸序列準(zhǔn)確性上可能產(chǎn)生所需增加，同時使所述方法有成本效益。專利技術(shù)概述本專利技術(shù)提供了用于對核酸分子的復(fù)制和擴(kuò)增進(jìn)行糾錯的方法和材料。在本專利技術(shù)的一個實施方案中，通過暴露于單向錯配內(nèi)切核酸酶來使具有核苷酸錯配的第一多個雙鏈核酸分子片段化。用內(nèi)切核酸酶在錯配位點或附近切割核酸分子，留下在所述分子的末端或近末端具有錯配的雙鏈核酸分子。在一個實施方案中，然后將所述核酸分子暴露于在5’至3’或3’至5’方向具有單向活性的外切核酸酶，從而去除錯配核苷酸。由去除了錯配核苷酸的核酸組裝第二多個雙鏈核酸分子。然后直接或在后續(xù)擴(kuò)增步驟，通過例如DNA聚合酶的作用填充所述缺失的核苷酸，并且如果有必要可重復(fù)這些步驟多次。結(jié)果是與第一多個核酸分子相比，雙鏈核酸分子的核苷酸錯配頻率降低。因此，一方面本專利技術(shù)提供了核酸分子糾錯的方法。所述方法涉及(a)獲得具有至少一個核苷酸錯配的第一多個雙鏈核酸分子；(b)通過使具有錯配的所述核酸分子與具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的至少一種分子反應(yīng)來使具有錯配的所述多個雙鏈核酸分子片段化；(c)通過使(b)的具有錯配的所述片段化雙鏈核酸分子與具有與(b)的所述單向錯配內(nèi)切核酸酶活性相同的方向性的單向外切核酸酶活性的至少一種分子反應(yīng)來去除所述核苷酸錯配，從而提供片段化無錯雙鏈核酸分子；和(d)組裝具有(c)的所述片段化無錯雙鏈核酸分子的第二多個雙鏈核酸分子。與所述第一多個雙鏈核酸分子相比，所述第二多個雙鏈核酸分子的核苷酸錯配頻率降低。在一個實施方案中，所述第一多個核酸分子可含有一個或多個合成核苷酸序列。所述第一多個核酸分子可含有一個或多個天然存在的基因序列和一個或多個合成核苷酸序列的混合物。在一個實施方案中可通過合成核酸分子，或在另一實施方案中可通過由亞型和/或寡核苷酸組裝所述核酸分子獲得第一多個核酸分子。在所述方法的一個實施方案中，上述步驟(b)和步驟(c)作為獨立反應(yīng)進(jìn)行，但是在另一實施方案中步驟(b)和步驟(c)作為同步或一步反應(yīng)進(jìn)行。在所述方法的一個實施方案中，所述單向錯配內(nèi)切核酸酶活性將5'切成所述錯配而所述單向外切核酸酶活性將所述核苷酸錯配從所述片段化核酸分子的5'末端去除。但是在另一實施方案中，所述單向錯配內(nèi)切核酸酶活性將3'切成所述錯配而所述單向外切核酸酶活性將所述核苷酸錯配從所述片段化核酸分子的3'末端去除。具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的分子的實例包括但不限于RESI、CELI、CELII、SP內(nèi)切核酸酶、SPI內(nèi)切核酸酶、T7內(nèi)切核酸酶、T4內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切核酸酶V、Mut蛋白質(zhì)、其中任一種的變體和以上任兩種或更多種的組合。在一個優(yōu)選實施方案中，利用CELI、CELII或CELI和CELII的組合。在另一優(yōu)選實施方案中，具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的分子由包含在低、中或高嚴(yán)格條件下與選自以下的核酸序列雜交的核苷酸序列的核酸分子編碼：a)在低、中或高嚴(yán)格條件下與選自SEQIDNO:01、SEQIDNO:03、SEQIDNO:05、SEQIDNO:07、SEQIDNO:09、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、任一種的補(bǔ)體和任一種的片段的核酸序列雜交的核酸序列；b)對選自SEQIDNO:01、SEQIDNO:03、SEQIDNO:05、SEQIDNO:07、SEQIDNO:09、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、任一種的補(bǔ)體和任一種的片段的核酸序列展現(xiàn)出70％或更高同一性的核酸序列；和c)編碼對選自SEQIDNO:02、SEQIDNO:04、SEQIDNO:06、SEQIDNO:08、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的氨基酸序列展現(xiàn)出60％或更高同一性的多肽的核酸序列。具有單向外切核酸酶活性的分子的實例包括但不限于外切核酸酶III、DNA聚合酶、λ外切核酸酶、T7外切核酸酶和T5外切核酸酶及其變體。在一個實施方案中，具有單向外切核酸酶活性的分子為具有校正活性(例如，3’外切核酸酶校正活性)的DNA聚合酶。具有校正活性的聚合酶的實例包括但不限于T4聚合酶、T7聚合酶和phi29聚合酶。在本專利技術(shù)方法的一個特定實施方案中，具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的所述至少一種分子選自：CELI、CELII、其中任一種的變體及其中任兩種或更多種的組合；并且具有單向外切核酸酶活性的所述至少一種分子選自外切核酸酶III、其變體及其中任兩種或更多種的組合。在本專利技術(shù)的一個方面，本專利技術(shù)提供了分離的核酸分子，其包含在低、中或高嚴(yán)格條本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種對核酸分子進(jìn)行糾錯的方法，所述方法包括：(a)獲得包含至少一個核苷酸錯配的第一多個雙鏈核酸分子；(b)通過使具有錯配的所述核酸分子與具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的至少一種分子反應(yīng)來使具有錯配的所述多個雙鏈核酸分子片段化；(c)通過使(b)的具有錯配的所述片段化雙鏈核酸分子與具有與(b)的所述單向錯配內(nèi)切核酸酶活性相同的方向性的單向外切核酸酶活性的至少一種分子反應(yīng)來去除所述核苷酸錯配，從而提供片段化無錯雙鏈核酸分子；和(d)組裝包含(c)的所述片段化無錯雙鏈核酸分子的第二多個雙鏈核酸分子，其中與所述第一多個雙鏈核酸分子相比，所述第二多個雙鏈核酸分子的核苷酸錯配頻率降低。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2012.02.01 US 61/593,8131.一種對核酸分子進(jìn)行糾錯的方法，所述方法包括：(a)獲得第一多個雙鏈核酸分子，其包含a)所需序列的核酸分子，和b)相對于所需序列具有至少一個核苷酸錯配的核酸分子；(b)通過使所述核酸分子與具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的至少一種分子反應(yīng)來使所述多個雙鏈核酸分子片段化；(c)通過使(b)的所述片段化雙鏈核酸分子與具有與(b)的所述單向錯配內(nèi)切核酸酶活性相同的方向性的單向外切核酸酶活性的至少一種分子反應(yīng)來去除所述至少一個核苷酸錯配，從而提供所需序列的片段化無錯雙鏈核酸分子；和(d)組裝包含(c)的所述片段化無錯雙鏈核酸分子的第二多個雙鏈核酸分子，其中與所述第一多個雙鏈核酸分子相比，所述第二多個雙鏈核酸分子具有更高比例的具有所需序列的核酸分子并且核苷酸錯配頻率降低，其中具有單向錯配內(nèi)切核酸酶活性的所述至少一種分子選自RESI、CELI、CELII、SP內(nèi)切核酸酶、SPI、T7內(nèi)切核酸酶、T4內(nèi)切核酸酶、和以上任兩種或更多種的組合，和其中具有單向外切核酸酶活性的所述至少一種分子選自外切核酸酶III、DNA聚合酶、λ外切核酸酶、T7外切核酸酶和T5外切核酸酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一多個核酸分子包含一個或多個合成核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一多個核酸分子包含一個或多個天然存在的基因序列和一個或多個合成核苷酸序列的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中獲得第一多個核酸分子包括合成所述核酸分子。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中獲得第一多個核酸分子包括由亞型和/或寡核苷酸組裝所述核酸分子。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)和步驟(c)作為獨立反應(yīng)進(jìn)行。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)和步驟(c)作為一步同步反應(yīng)進(jìn)行。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述單向錯配內(nèi)切核...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·吉布森，N·卡亞扎，T·理查德松，
申請(專利權(quán))人：合成基因組股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US