本發明專利技術公開了一種食管癌相關的MAGE-A4和NY-ESO-1蛋白表達的長度為9個氨基酸的肽段，所述肽段的氨基酸序列見序列表中的序列1至序列6中的任意一個。本發明專利技術還提供了這些抗原肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的復合物及其制備方法，復合物包括gp96和HSP78與抗原多肽以非共價鍵結合的復合體，和二者以共價鍵連接形成的融合蛋白。這些肽段單獨或形成的復合物可以誘導針對食管癌的特異性的CTL。這種復合物可用于制備治療食管癌的治療性疫苗。
【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了一種食管癌相關的MAGE-A4和NY-ES0-1蛋白表達的長度為9個氨基酸的肽段，所述肽段的氨基酸序列見序列表中的序列1至序列6中的任意一個。本專利技術還提供了這些抗原肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的復合物及其制備方法，復合物包括gp96和HSP78與抗原多肽以非共價鍵結合的復合體，和二者以共價鍵連接形成的融合蛋白。這些肽段單獨或形成的復合物可以誘導針對食管癌的特異性的CTL。這種復合物可用于制備治療食管癌的治療性疫苗。【專利說明】食管癌相關肽和熱休克蛋白形成的復合物及其應用
本專利技術屬于生物
，特別涉及食管癌抗原多肽與熱休克蛋白gp96和HSP78 的復合物以及它們抗食管癌的用途。
技術介紹
食管癌在我國每年發病和死亡人數都占全球人數一半以上，是最具中國特色的惡 性腫瘤之一，年發病率超過22/10 5。在我國，食管癌以食管鱗癌為主，占95%以上。由于食 管癌早期癥狀不典型，50%的患者在診斷時已為晚期。食管癌手術后仍有近90%的患者術 后復發轉移，術后5年生存率僅維持在30%左右，年死亡率超過16/10 5。 化療是常規治療手段,然而食管癌對目前的化療藥物多為中度或低度敏感,加之 食管癌多數為分化程度差異較大的鱗癌細胞，以及抗藥性存在等因素，使食管癌化療效果 較難提高。標準治療方案順鉬聯合5-FU的方案完全緩解也是很少見的，中位緩解時間通常 很短。 近年來，靶向治療已成為腫瘤治療熱點。然而由于腫瘤差異性比較大，靶向藥物的 療效不均一，同時，靶向藥物還存在耐藥性的問題，且食管癌發生地多為貧窮地區，靶向藥 物的昂貴費用也讓患者望而卻步。 近年來，免疫治療作為第四大腫瘤治療模式已成研究熱點。在臨床上食管鱗癌組 織中檢測到gp96的高表達，表達水平和腫瘤預后呈正相關。小鼠成瘤實驗中也證實在已成 形的鱗狀食管癌細胞系瘤體中注射自體gp96可以明顯減慢腫瘤的生長，gp96可以激起更 強的腫瘤特異性殺傷。我們的臨床試驗也表明食管癌患者皮下免疫自體腫瘤gp96復合物 可以增強患者腫瘤特異性的CTL反應。因此，熱休克蛋白gp96治療食管癌極有可能取得非 常好的療效。 gp96是熱休克蛋白HSP90家族中的重要成員，主要定位于內質網腔（Endoplasmic Reticulum)，在正常組織和腫瘤中均有廣泛表達。正常情況下gp96在細胞中呈低水平表 達，而熱休克、葡萄糖缺乏、細菌和病毒感染等均可增加其表達。在細胞內gp96作為分子 伴侶蛋白，可阻止蛋白質聚集，協助蛋白質折疊、伸展、組裝和轉運，抑制錯折疊蛋白質的分 泌。gp96分子具有多肽結合的能力，能結合5-25個氨基酸的多肽序列。熱休克蛋白HSP78 是細胞質中HSP70家族中的成員，分子量約78kDa。HSP78分子作為分子伴侶能與細胞中各 種短肽結合。 在細胞外，gp96可作為呈遞分子將結合的短肽呈遞給I類MHC分子，激活特異性 和記憶性T細胞，引發機體細胞免疫反應。因此HSP本身不具備抗原性，所結合的短肽決定 了復合物的抗原性。gp96還可以活化樹突細胞（DC)促進MHC I類和MHC II類分子以及共 刺激因子的表達，從而提高免疫反應。 目前已證實gp96和hsp78分子可以結合多種結合抗原多肽，包括泡狀口炎病毒 抗原區肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒 抗原肽等。但目前為止未見從食管癌患者腫瘤組織中分離鑒定與HSP結合的抗原多肽。 食管癌是嚴重的消化系統惡性腫瘤。前期的動物試驗和臨床試驗顯示，自體gp96 治療食管癌應該會有不錯的效果。然而，由于食管解剖結構的特殊性，組織大小是限于這種 治療方法應用的一個關鍵，同時疫苗制備具有一次性的特點，能夠完成有效療程的患者有 限，gp96免疫治療食管癌仍存在很多不足。
技術實現思路
因此，本專利技術要解決的技術問題是篩選能激活食管癌特異性T細胞的肽段。克服 腫瘤細胞免疫編輯導致的低免疫原性，能夠在健康個體及食管癌患者中誘導產生特異性細 胞毒性T淋巴細胞（殺傷性T細胞，CTL)，而且CTL具有強大的抗食管癌作用，對正常細胞 及組織無破壞作用。 本專利技術的一個目的是提供一種與gp96和HSP78結合的食管癌抗原的復合物。所述 的食管癌抗原可以分別是食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋白上第49-57位的氨基酸序列，其序 列可以是GTLEEVPAA，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋白上第24-32位的氨基酸 序列，其序列可以是GLVGAQAPT，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋白上第202-210 位的氨基酸序列，其序列可以是LLIIVLGTI，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原MAGE-A4蛋 白上第46-54位的氨基酸序列，其序列可以是LVPGTLEEV，或其變異序列；食管癌腫瘤抗原 NY-ES0-1蛋白上第71-79位的氨基酸序列，其序列可以是GLNGCCRCG，或其變異序列；食管 癌腫瘤抗原NY-ES0-1蛋白上第124-132位的氨基酸序列，其序列可以是KEFTVSGNI，或其變 異序列。 本專利技術的復合物既包括熱休克蛋白以非共價鍵與多肽結合，又包括熱休克蛋白以 共價鍵與多肽結合。本專利技術提供了制備本專利技術的如上所述抗原多肽與熱休克蛋白gp96和 HSP78的復合物的方法。 本專利技術所訴的表位肽可以單獨或以熱休克蛋白復合物形式在HLA-A2轉基因小鼠 中誘導形成特異性的CTL。 本專利技術所訴的表位肽可以在體外單獨或以熱休克蛋白復合物形式刺激HLA-A2陽 性食管癌患者PBMC分泌IFN- γ，且這種作用在自體gp96免疫后顯著增強。 本專利技術所訴的表位肽可以單獨或以熱休克蛋白復合物形式提高HLA-A2陽性食管 癌患者特異性T細胞反應。 本專利技術所述的特異性CTL的誘導可以被Treg細胞的抑制劑增強。 首次從五例食管癌腫瘤組織中與熱休克蛋白gp96結合的多肽中分離出一特異9 肽，經氨基酸序列分析為"GTLEEVPAA"，經查詢發現該序列位于食管癌特異性抗原MAGE-A4 的49-57位，人工合成該序列并與體外表達的gp96蛋白組裝，體外合成gp96-9肽復合物， 將該gp96-9肽復合物免疫HLA-A2轉基因小鼠，能刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞 (CTL)，且應用調節性T細胞的抑制劑可以增強gp96-9肽復合物的免疫效果2倍以上。實 驗結果表明gp96-9肽復合物可開發成為一種新型食管癌的治療性藥物。 附圖簡要說明 圖1.小鼠（BALB/CHLA42+)的特異性CTL反應。以9肽和gp96-9肽復合物按0、1、3周 的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后檢測特異性細胞裂解率。效應細胞CTL對特異性靶 細胞的裂解百分率以4小時標準51Cr釋放法測定，效應細胞與靶細胞之比分別是10、25、50 和100,圖中裂解率為10只小鼠平均值。 圖2. gp96_肽段1免疫的小鼠脾臟淋巴細胞可抑制裸鼠皮下接種的食管癌細胞的 生長。裸鼠皮下接種人食管癌細胞TE-1，荷瘤7天后轉輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細胞。 抗原肽1組（n=20)的接受經過gp9本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種與熱休克蛋白結合的表位肽GTLEEVPAA，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃錫堅，張小俊，
申請(專利權)人：深圳市康爾諾生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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