一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因及其應用，本申請首次利用第二代Solexa?HiSeq2000進行茯苓的轉錄組測序及Denovo拼接，分析找到茯苓中編碼CAP的候選基因并進行體外克隆表達，獲得的基因序列為SEQ?ID?NO.1所示，編碼的蛋白質為SEQ?ID?NO.2所示。將其通過轉基因技術在茯苓中過表達，發現其可加快茯苓菌核的形成及提高菌核產量。

【技術實現步驟摘要】
一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因及其應用
本專利技術屬于生物技術和藥用真菌基因工程領域，主要涉及利用生物信息學和分子生物學手段，分析茯苓轉錄組數據，克隆茯苓中腺苷酸環化酶相關蛋白基因及其編碼產物與應用。
技術介紹
多孔菌科真菌茯苓(Wolfiporiacocos)的菌核是我國常用的大宗藥材品種之一，具有極高的藥用價值和膳食營養價值。據不完全統計，近年來全國對茯苓的年需求量高達17000噸左右，年出口量近5000噸，在日本、韓國和東南亞等地的市場的需求量大，具有極大的經濟價值。傳統的茯苓生產模式采用松樹作為原料，進行斷木栽培。這種方法依賴于松木資源，且容易遭受氣候的影響，導致我國茯苓的種植規模受到制約。因此鑒定茯苓菌核形成相關基因，深入研究基因功能，對優化茯苓種植模式和提高茯苓產量，促進茯苓產業化的發展具有重要的指導意義。有研究表明，在真菌菌核發育形成這一極其復雜的的生物學過程中，G-蛋白，cAMP-PKA等信號轉導通路具有重要作用，其中，cAMP信號途徑在絲狀真菌菌落生長發育、產孢、抗逆性、致病性等方面均有重要調控作用。腺苷酸環化酶相關蛋白(Adenylatecyclase-associatedprotein,CAP)基因最初是在出芽酵母中發現，是營養信號Ras基因調控的腺苷酸環化酶下游細胞信號受體，在細胞骨架肌動蛋白的調控及細胞信號轉導中發揮重要作用。在白假絲酵母菌中，CAP參與酵母相轉為菌絲相生長的過渡過程，并與Ras和腺苷酸環化酶一起調節細胞內的cAMP水平。本專利技術首次利用第二代SolexaHiSeq2000進行茯苓菌核的轉錄組測序及Denovo拼接。分析找到茯苓中編碼CAP的候選基因并進行體外克隆表達，驗證其功能。為茯苓菌核形成的相關分子機理提供理論基礎。在本專利技術被公布之前，尚未有任何公開報道過本專利申請中所提及的茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因及其氨基酸序列。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因，本專利技術稱為CAP基因，其序列為SEQIDNO.1所示。本專利技術另一個目的是提供一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因編碼的蛋白質，其序列為SEQIDNO.2所示。本專利技術最后一個目的在于提供一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因在加快茯苓菌核形成中的應用，還包括增加藥用茯苓產量中的應用。為了達到上述目的，本專利技術采取以下技術措施：一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因(以下簡稱CAP基因)，其制備方法如下：以茯苓cDNA為模板，設計正向引物CAPP1：5'-ATGTCTCAGGGCGGCTTAC-3'，反向引物CAPP2：5'-CTAGCCTGCATGCTCGACC-3'進行PCR擴增，擴增體系如下：10×PCRbuffer2.5ul，dNTP1ul，引物P1和P2各1ul，Taq酶0.5ul，模版1ul，其余用水補足，總體積共25ul。94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，72℃保存5min，35個循環。最終獲得了CAP基因基因，其序列為SEQIDNO.1所示，編碼的蛋白質為SEQIDNO.2所示。一種茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因加快茯苓菌核形成(提高茯苓菌核產量)中的應用，其應用過程如下：將茯苓CAP蛋白(SEQIDNO.2所示氨基酸)對應的基因(優選SEQIDNO.1所示的核苷酸序列)通過PEG介導的遺傳轉化轉入茯苓原生質中，然后按常規方式進行茯苓的接種及栽培，可獲得高產茯苓菌核的轉基因茯苓。本專利技術的所要保護的內容還包括：編碼SEQIDNO.2所示氨基酸的核苷酸序列；優選SEQIDNO.1所示的核苷酸序列含有本專利技術的茯苓CAP基因全序列或其ORF序列的重組載體，如原核類載體，真核類表達載體及RNAi載體均屬于本專利技術的保護范圍。包括但不限于pCAMBIA3300和pBI101。含有本專利技術的茯苓CAP基因全序列或其ORF序列的宿主細胞，如含有上述的重組載體的宿主細胞也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術中宿主細胞為原核細胞或者真核細胞。包括但不限于大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。本專利技術的茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白(CAP)基因的應用，包括用所述的茯苓CAP基因全序列或其ORF序列轉化獲得轉基因生物體，包括但不限于煙草，擬南芥，茯苓。本專利技術中宿主細胞為原核細胞或者真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌；常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。利用本專利技術的茯苓CAP，通過各種常規篩選方法，可篩選出與茯苓CAP發生相互作用的物質，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。與現有技術相比，本專利技術具有以下優點：本專利技術所提供的茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白(CAP)基因是首次從茯苓中克隆制備的，利用本專利技術的技術可以對茯苓等藥用真菌進行基因工程改造，CAP在細胞骨架肌動蛋白的調控及細胞信號轉導中發揮重要作用。因此，利用本專利技術分離的CAP基因，利用轉基因技術得到高產量的茯苓菌核，為茯苓的工業化生產提供了技術支撐。同時，本專利技術的CAP基因在茯苓菌核發育形成過程中的作用及其調控機制，為精準調控茯苓菌核發育形成條件、優化現有的種植模式以及提高產量提供重要的理論依據。附圖說明圖1為茯苓RNA的電泳圖。圖2為CAP功能域預測分析。圖3為CAP系統進化樹。圖4為表達載體pGEX-GST-CAP構建示意圖。圖5為CAP蛋白表達電泳圖具體實施方式實施例1：茯苓轉錄組文庫的構建1.樣品采集茯苓來源于云南省和大別山區茯苓種植基地，取其不同生長時期的菌核置于液氮中速凍后，于-80℃冰箱中冷凍保存。2.茯苓總RNA的分離和檢測針對茯苓中多酚和多糖類物質含量較高的特點，首先對-80℃保存的樣本于液氮中充分研磨，然后采用優化的Trizol法對樣本進行總RNA的提?。喝^程保證在低溫條件下進行，并加入一定濃度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并適當加大β-巰基乙醇的濃度，當離心去除PVP和β-巰基乙醇后，再采用高濃度NaAc溶液析出RNA，DNase去除殘留DNA完成RNA的純化。最后用1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性(圖1)，用Nanodrop2000核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置于-80℃冰箱備用。3.轉錄組測序(RNA-Seq)利用oligo(dT)的磁珠從總RNA中富集mRNA，接著加入fragmentationbuffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物(randomhexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二條cDNA鏈，在經過QiaQuickPCR試劑盒純化并被EB緩沖液洗脫之后進行末端修復、加poly(A)并連接測序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離并選擇片段大小，PCR擴增構建測序文庫，利用第二代SolexaHiSeq2000進行RNA測序，及Denovo拼接。通過Blast比對分析、GO注釋及MEGA5.0構建系統發育樹(圖3)方法找到茯苓中編碼CPA的候選基因。實施例2：茯苓腺苷酸環化酶相關蛋白基因的克隆分析候選基因讀碼框范圍，以茯苓cDNA為模板，設計引物正向引物CAPP1：5'-ATGTCTCAGGGCGGCTTAC-3'，反向引物CAPP2：5本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的蛋白質，其序列為SEQ?ID?NO.2所示。

【技術特征摘要】
1.一種分離的蛋白質或編碼該蛋白的基因在提高茯苓菌核產量中的應用，所述的蛋白質的氨基酸序列為SEQIDNO.2所示。2.一種分離的蛋白質或編碼該蛋白的基因在加快茯苓菌核形成中的應用，所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：朱聞君，孫巧，湯進，陳平，張紹鵬，宋佳，李長玲，鄧琛，
申請(專利權)人：朱聞君，孫巧，湯進，陳平，張紹鵬，宋佳，李長玲，鄧琛，
類型：發明
國別省市：湖北;42