本發(fā)明專利技術提供了一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒及檢測方法，所述試劑盒主要包括：固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜，雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，生物素或鏈霉親和素標記的多聚酶，以及與所述多聚酶對應的底物顯色劑；本發(fā)明專利技術試劑盒可高靈敏地定性或半定量地快速檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體IgE濃度，并可一次篩查數(shù)十種過敏原，快速、準確、樣品用量少，適宜進行高通量檢測。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
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本專利技術涉及一種高靈敏地定性或半定量地篩査或檢測人血清或血漿中的多個過 敏原特異性I班抗體水平的檢測試劑盒，及其檢測方法。 (二）
技術介紹
2011?2012年世界變態(tài)反應組織（WAO)關于變態(tài)反應(也稱過敏反應，Allergy) 的白皮書指出：過敏性疾病的流行在發(fā)達國家和發(fā)展中國家全世界范圍內(nèi)正戲劇性地上 升。過敏性疾病包括過敏性哮喘、過敏性鼻炎、嚴重過敏反應，藥物、食物及昆蟲過敏反應， 濕疹、専麻疹(枯草熱）和血管性水腫。過去二十年尤其是兒童患過敏性疾病人數(shù)的增加有 暴發(fā)的趨勢。（Pawankar R et al, WAO White Book on Allergy2011-2012;Executive Summary.)僅食物引發(fā)的過敏性疾病的流行率就達3%?6%D(Sicherer S H，Epidemiology of food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2011 ;127 :594-602.)過敏性疾病是患者吸入 或攝食入含有致敏成分的物質(zhì)(稱為過敏原或變應原，Allergen)后觸發(fā)機體的B細胞產(chǎn)生 過量的免疫球蛋白E (Immunoglobulin E，I班），當I班抗體在體內(nèi)再次接觸過敏原時就與 過敏原交聯(lián)結合到服大細胞和嗜堿性粒細胞表面上的高親和受體化e Rl上，導致化e Rl 受體的聚集，使服大細胞和嗜堿性粒細胞活化。服大細胞在活化過程中脫顆粒并釋放儲存 在細胞漿顆粒里的炎性介質(zhì)：組胺，與通過花生四帰酸途徑合成的白H帰、免疫反應性前列 腺素和IL4、IL5等細胞因子及趨化因子，引發(fā)過敏反應的疾病癥狀。過敏性疾病的發(fā)生， I班抗體起關鍵作用，稱為I班介導的過敏反應（即Gell-CoombsI型超敏反應，或稱I班介 導的速發(fā)性超敏反應)。I班介導的過敏性疾病的特征是患者體內(nèi)循環(huán)血液中的過敏原特異 性I班（Si班）抗體濃度較正常狀況下高，且病癥越嚴重，Si班抗體濃度越高。（Bloebaum 民 M et al，2004， Mechanisms of IgE-mediated allergic reactions， In :Lockey RF et al ed， Allergens and allergen immunotherapy， Marcel Dekker， Inc， New York， USA， PP65-84.) 過敏性疾病的臨床診斷在美國臨床醫(yī)師實用指南中指出，根據(jù)患者病史結合 點刺或血液檢測過敏原特異性I班（Si班）抗體濃度，篩查致病過敏原（Siles R I， Hsieh F H, Allergy blood testing：A practical guide for clinicians. Am Clin J Medicine. 2011 ;78 :585-592.)。目前，檢測血液中過敏原特異性I班（si班）抗體濃度， 篩查致病過敏原的方法有酶免疫法（EIA)、免疫印跡法（Immunoblotting Assay)、膠體金 側流層析法化FA)、蛋白芯片法（Proteins microarray)等，發(fā)展趨勢并符合市場要求的 是：自動化、快速、準確、樣品用量少，一次篩查幾十種過敏原。市場上產(chǎn)品不少，其中，瑞 典Pharmacia公司產(chǎn)品ImmunoCAP250系統(tǒng)是酶免疫法的代表，ImmunoCAP Rapid是膠體金 側流層析法的代表，ImmunoCAP ISAC是蛋白芯片法的代表，開創(chuàng)了過敏原分子診斷；而德 國Mediwiss-anal}ftic公司的AllergyScreen則是免疫印跡法的代表（AIIeisaScreen飯 Immunoblot for analysing specific IgE in human serum)。因人血液中 IgE 抗體平均 濃度?0. 00加g/ml，是總免疫球蛋白平均濃度的0. 002%，Si班抗體濃度更低，為滿足自動 化、快速、準確、樣品用量少，一次篩查幾十種過敏原，半定量或定量檢測樣品中的過敏原特 異性I班（Si班）抗體濃度的要求，必須配置光電信號放大的檢測儀，或生物化學方法的信 號放大系統(tǒng)。如，瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品ImmunoCAP Rapid -次只能篩查十來種過敏原， 不配閱讀儀，肉眼判讀Si班抗體濃度的靈敏度只有l(wèi).OIU/ml (1IU I班=2.44ngl班），用 1. 49IU/ml區(qū)分陰性和陽性結果。 (H)
技術實現(xiàn)思路
本專利技術目的是提供一種使用生物化學方法的信號放大系統(tǒng)(雙生物素-鏈霉親和 素和多聚酶的二級信號放大系統(tǒng)）來高靈敏地檢測過敏原特異性抗體I班的檢測試劑盒及 檢測方法，用W定性或半定量地快速檢測人血清或血漿中的過敏原特異性抗體I班濃度， 并可一次篩查數(shù)十種過敏原。 本專利技術采用的技術方案是： 一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體I班的試劑盒，主要包括；固化有待測過敏原 蛋白的纖維材料膜，雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人I班抗體(可市購獲 得，使用時用抑7. 4的含0. 05%Tween20的PBS配制成濃度1 ; 100?10000的工作液)，生 物素或鏈霉親和素標記的多聚酶(可市購獲得，使用時用酶緩沖液配制成濃度1 :5000? 50000的工作液)，W及與所述多聚酶對應的底物顯色劑(可市購獲得，也可自行配制）；所述 雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液為雙生物素：鏈霉親和素摩爾濃度比24?39 ; 18的混合物溶 液，所述人I班抗體為羊抗人I班抗體或兔抗人I班抗體，所述多聚酶為多聚堿性磯酸酶或 多聚辣根過氧化物酶。上述為試劑的主要成分，不包含檢測所用的常規(guī)試劑如稀釋液、洗涂 液等。 所述雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液可按如下方法配制： (1)將雙生物素溶解在己醇/二甲基亞諷（85/15, V/V)溶液中，制得濃度為 1. Immol/L 得 A 液； (2)用0. 05mol/L的PBS配制1. Omg/mL的鏈霉親和素溶液，得B液； (3)在劇烈旋潤下，按照其摩爾比，緩緩將A液加入B液內(nèi)，即得所述雙生物素-鏈 霉親和素優(yōu)化液。 優(yōu)化液中雙生物素分子和鏈霉親和素分子混合的比例可為12 ;9、7 ;6、19 ;9、13 ;6 等，見圖1和圖2所示。 優(yōu)選的，所述纖維材料膜可固置于反應槽的加液孔中，將該反應槽直接作為試劑 盒成分。所述反應槽可如圖4所示。 所述纖維材料膜為硝酸纖維素膜，混合纖維素醋膜或者多孔PVF膜等(可市購獲 得)，具有足夠抗彎曲和抗折皺機械強度，固化待測過敏原蛋白后固置于反應槽內(nèi)。纖維材 料膜隨需固化的過敏原蛋白不同，可分別采用漠化膳、戊二酵、駿基變性、氨基變性、氯甲基 變性等方法活化纖維材料膜，使之能共價結合足量（0. 2?2. Oug)的相應的過敏原蛋白，W 便能充分結合樣品液中的Si班抗體，確保檢測結果的準確性。 所述過敏原蛋白可按常規(guī)方法從下列天然原材料中提取，包括：植物花粉類(樹花 粉類、草花粉類及野草花粉類等）過敏原；霉菌類過敏原；動物皮屑類過敏原；昆蟲類過敏 原；植物食物類(包括水果類、蔬菜類、堅果類、食用菌類及谷物類）過敏原和動物食物類(包 括肉類、禽蛋類、魚和甲殼類及奶類）過本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒，主要包括：固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜，雙生物素?鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，生物素或鏈霉親和素標記的多聚酶，以及與所述多聚酶對應的底物顯色劑；所述雙生物素?鏈霉親和素優(yōu)化液為雙生物素：鏈霉親和素摩爾濃度比24～39:18的混合物溶液，所述人IgE抗體為羊抗人IgE抗體或兔抗人IgE抗體，所述多聚酶為多聚堿性磷酸酶或多聚辣根過氧化物酶。
【技術特征摘要】
1. 一種高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的試劑盒，主要包括：固化有待測過敏原蛋 白的纖維材料膜，雙生物素-鏈霉親和素優(yōu)化液，生物素偶聯(lián)的抗人IgE抗體，生物素或鏈 霉親和素標記的多聚酶，以及與所述多聚酶對應的底物顯色劑；所述雙生物素-鏈霉親和 素優(yōu)化液為雙生物素：鏈霉親和素摩爾濃度比24?39:18的混合物溶液，所述人IgE抗體 為羊抗人IgE抗體或兔抗人IgE抗體，所述多聚酶為多聚堿性磷酸酶或多聚辣根過氧化物 酶。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述纖維材料膜固置于反應槽的加液孔 中。3. 利用權利要求1或2所述試劑盒高靈敏檢測過敏原特異性抗體IgE的方法，所述方 法包括如下順序步驟： (1) 取加液孔內(nèi)固置有固化有待測過敏原蛋白的纖維材料膜的反應槽，室溫下水平放 置賃備用； (2) 將200?400 μ L血清或血漿加入1?2mL樣品稀釋液中，混勻后加入反應槽的加 液孔內(nèi)，將反應槽置于混勻器上，室溫孵育30?60分鐘； ...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：臧榮春，吳善東，
申請(專利權)人：杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33
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