一種嗜熱厭氧桿菌及利用其生產乙醇的方法技術

本發明專利技術涉及微生物菌株領域，特別涉及一種嗜熱厭氧桿菌及利用其生產乙醇的方法。本發明專利技術菌株為長白云嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium?aotearoense)P8G3#4，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?NO.9000，保藏日期為2014年4月3日。利用所述菌株生產乙醇的方法：首先配制嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000的種子液，然后將嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000種子液以10-15％w/w接種量轉接到發酵培養基中，在厭氧條件下攪拌培養，最后從發酵液分離出乙醇。該菌株遺傳穩定性好，產量性狀穩定，發酵遲滯期縮短至原來的1/4，節省了耗能。

【技術實現步驟摘要】
一種嗜熱厭氧桿菌及利用其生產乙醇的方法
一種生產乙醇的菌株和其高濃度糖耐受提高的馴化方法，以及利用該菌株生產乙醇的方法。本專利技術涉及以葡萄糖、木糖為主要原料，利用嗜熱厭氧桿菌(ThermoanaerobacteriumaotearoenseSCUT27/Δldh)突變株發酵生產乙醇的方法。
技術介紹
乙醇是一種新型清潔燃料，是可再生能源開發利用的重要方向。發展生物乙醇是大勢所趨。第二代生物乙醇利用植物纖維經過預處理、無機酸或纖維素酶水解再通過生物發酵方式生產。而氫能因其清潔、能量密度高、制取方法多樣等特點，吸引著研究者們的關注。以纖維質類物質為原料發酵生產乙醇的主要障礙在于成本過高。采用嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterium)發酵能夠較好的解決該困難。以其為發酵菌株生產化學品具有如下幾方面的優勢(O-Thong,S.etal.,InternationalJournalofHydrogenEnergy,2008.33(4)：1204-1214)：(1)降低以纖維質類原料發酵過程中的纖維素酶添加量。這是因為該類菌株本身即是一類半纖維素分解微生物，其能夠在高溫下水解木聚糖發酵產生多種化學品，從而減少了纖維素酶的需求量。(2)高溫連續發酵生產過程，有利于乙醇的分離純化。(3)可以生料發酵生產乙醇。由于工業規模發酵生產乙醇過程中，純種發酵對于設備的無菌要求較高，因此大幅增加了經濟成本。但采用嗜熱菌發酵生產，由于絕大部分常溫微生物較難在高溫下生產，因此對發酵過程的無菌要求不高，從而進一步降低了生產成本。(4)能夠利用高溫有機廢水為發酵原料，這一方面降低了生產成本，另一方面也減輕了環境壓力。申請人前期研究中篩選到一株嗜熱厭氧桿菌(Li,S.,etal.,BioresourceTechnology,2010,101(22)：8718-8724，Cai,Y.,etal.,EnzymeandMicrobialTechnology,2011.48(2):p.155-161)，該菌株能夠有效利用葡萄糖、木糖等底物發酵積累乙醇、氫氣等。通過對其進行基因改造，敲除乳酸脫氫酶基因，代謝途徑改造后，突變體H2和乙醇產量分別提高了2.7和2.4倍。但該菌株在高濃度糖底物情況下，受到高糖滲透應激的影響，導致生長遲滯期過長，導致發酵周期過久，生產成本大幅度增加。而高濃度糖底物耐受是實現纖維素類生物質同步糖化發酵生產乙醇所必須的。從工業化角度來看，如果能夠篩選到一株耐高糖的嗜熱厭氧桿菌菌株，提高嗜熱厭氧桿菌糖底物濃度耐受性，且性狀穩定，可應用于高濃度糖底物發酵，縮短發酵遲滯期，減少工藝放大成本，這樣才能更適合工業化生產。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種生產乙醇的菌株及利用該菌株生產乙醇的方法。將出發菌株嗜熱厭氧桿菌(ThermoanaerobacteriumaotearoenseSCUT27/Δldh)P8G0(紅霉素抗性)按照逐步提高糖底物濃度的方法進行培養，重復數代，直到得到在此濃度下能夠在接種6h后菌體OD600長至0.6而且性狀穩定。取1mL菌液加到分離培養基中，在厭氧培養箱中培養2-3天，挑取單菌落，在發酵培養基中培養240h后，乙醇終濃度達28.11g/L，轉化率達1.22mol/mol，最后得到能在高濃度底物下能夠正常生長、傳代的突變株P8G3#4(紅霉素抗性)。上述突變株為長白云嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)P8G3#4，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCCNO.9000，保藏日期為2014年4月3日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。所述P8G3#4菌株為：革蘭氏陽性菌，長桿狀，直徑約0.6-1.0μm，長約2-15μm，顯微鏡下觀察其可翻滾運動。為嚴格厭氧菌，最適生長溫度為55℃，pH6.3，可利用多種糖底物生長，如葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、海藻糖、木聚糖、葡聚糖等。該菌株的遺傳特性為：乳酸代謝阻斷型突變株，具有紅霉素抗性，紅霉素抗性濃度為20-100ng/μl。能耐受120-150g/L糖底物濃度，細胞內UDP-Gal(UDP-α-D-半乳糖)和1-(5-磷酸-D-核糖)-5-氨基-4-咪唑羧酸(CAIR)積累增加；甘油磷脂代謝途徑中的mtGDP的表達下調。利用權利要求1所述菌株生產乙醇的方法：首先配制嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000的種子液，然后將嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000種子液以10-15％w/w接種量轉接到發酵培養基中，在厭氧條件下攪拌培養，培養溫度45-60℃，培養時間為50-250小時，最后從發酵液分離出乙醇。所述發酵培養基的總糖濃度為80-150g/L。所述發酵培養基的初始pH為5.5-6.5，所述攪拌轉速為120-200rpm。所述發酵培養基的初始pH為6.3。所述發酵培養基成分為：葡萄糖80-100，木糖40-60，尿素1-10，酵母抽提物1-5，氯化銨0.5-3，單位g/L。所述發酵培養基還包括如下成分：檸檬酸三鉀鹽1-4，一水檸檬酸0.5-3，硫酸鈉0.5-3，磷酸二氫鉀0.5-3，碳酸氫鈉1-4，六水氯化鎂0.5-3，四水氯化亞鐵0.05-0.5，二水氯化鈣0.05-0.4，一水半胱氨酸鹽酸0.5-3，二鹽酸吡哆胺0-0.1，對氨基苯甲酸0-0.01，D-生物素(D-biotin)0-0.01，維生素B120-0.01，維生素B10-0.01，單位g/L。所述種子液的配制：將嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000置于種子培養基中，在45-60℃，轉速為100-250rpm，培養8-24h。所述種子培養基為：葡萄糖2-4，木糖2-4，其它組分與發酵培養基相同。主要為尿素1-10，酵母抽提物1-5，氯化銨0.5-3，單位g/L。優選地，還包括如下成分：檸檬酸三鉀鹽1-4，一水檸檬酸0.5-3，硫酸鈉0.5-3，磷酸二氫鉀0.5-3，碳酸氫鈉1-4，六水氯化鎂0.5-3，四水氯化亞鐵0.05-0.5，二水氯化鈣0.05-0.4，一水半胱氨酸鹽酸0.5-3，二鹽酸吡哆胺0-0.1，對氨基苯甲酸0-0.01，D-生物素(D-biotin)0-0.01，維生素B120-0.01，維生素B10-0.01，單位g/L。與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：(1)以本實驗室篩選、構建得到的嗜熱厭氧桿菌P8G0為親株，按常規方法進行高糖底物耐受性馴化，得到突變株P8G3#4。該突變株具有以下遺傳特性：L-乳酸脫氫酶缺陷型，紅霉素抗性，糖底物濃度耐受范圍超過120-150g/L，細胞內UDP-Gal(UDP-α-D-半乳糖)和1-(5-磷酸-D-核糖)-5-氨基-4-咪唑羧酸(CAIR)積累增加；甘油磷脂代謝途徑中的mtGDP的表達下調。(2)以120g/L葡萄糖、木糖混合糖為底物在5L發酵罐發酵生產乙醇，遲滯期縮短至原來的約1/4，乙醇終濃度達28g/L，轉化率達1.2mol/mol。本專利技術提供篩選的突變體，能夠利用高糖底物快速發酵積累目標產品乙醇，且產生的副產物少，工藝放大較為容易，適合于工業化生產。附圖說明圖1為馴化后的耐高糖菌株P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種嗜熱厭氧桿菌，其特征在于，該菌株為長白云嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium?aotearoense)P8G3#4，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?NO.9000，保藏日期為2014年4月3日。

【技術特征摘要】
1.一種嗜熱厭氧桿菌，其特征在于，該菌株為長白云嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumaotearoense)P8G3#4，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNO.9000，保藏日期為2014年4月3日。2.一種利用權利要求1所述菌株生產乙醇的方法，其特征在于，首先配制嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000的種子液，然后將嗜熱厭氧桿菌CGMCC9000種子液以10-15％w/w接種量轉接到發酵培養基中，在厭氧條件下攪拌培養，培養溫度45-60℃，培養時間為50-250小時，最后從發酵液分離出乙醇。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的總糖濃度為80-150g/L。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的初始pH為5.5-6.5，所述攪拌轉速為120-200rpm。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的初始pH為6.3。6.根據權利要求2或3或4或5所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基成分為：葡萄糖80-100，木糖40-60，尿素1-10，酵母抽提物1-5，氯化銨0.5-3，單位g/L。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基還包括如下成分：檸檬...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李爽，賴志城，王菊芳，
申請(專利權)人：華南理工大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44