用于減弱結核分枝桿菌復合群的細菌以生產結核病疫苗的方法技術

本發明專利技術涉及結核分枝桿菌復合群的分枝桿菌株在生產用于預防宿主中結核分枝桿菌復合群的細菌感染的疫苗的用途，在結核分枝桿菌復合群的分支桿菌株中插入有能夠表達恥垢分枝桿菌孔蛋白A的mspA基因，所述宿主包含真核細胞優選巨噬細胞，其中如此轉化的所述分枝桿菌株在所述真核細胞中顯示出降低的生長。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于減弱結核分枝桿菌復合群的細菌以生產結核病疫苗的 方法
技術介紹
結核病是一種影響人類和動物的傳染性疾病，由于該物種之一的結核分枝 桿菌（Mycobacterium tuberculosis)復合群（complexe)，即特別是結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)(以及由其衍生 的 BCG 株）、非洲分枝桿菌（Mycobacterium africanum)、卡氏分枝桿菌（Mycobacterium canettii)、山羊分枝桿菌（Mycobacterium caprae)、田鼠分枝桿菌（Mycobacterium microti)和海豹分枝桿菌（Mycobacterium pinnipedii)[19]以及 Mycobacterium mungii (20)。結核病每年在世界各地引起約900萬新發感染病例，并且每年殺死約300萬 人。HIV感染流行與發達國家結核病的重新出現同時出現，并且令人擔憂的是伴有耐受一線 抗結核病抗生素的結核分枝桿菌菌株的出現。結核病是一種傳染性疾病，可以傳染自患有 桿狀肺結核的人，即在吐出物中排出結核分枝桿菌復合群的活分枝桿菌的人。 在很長一段時間，預防肺結核是基于接種卡介苗（BCG)，這是一種牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis)的減毒株，一種和結核分枝桿菌非常密切相關的分枝桿菌屬，并且 也在人類與動物中引起結核病，主要是牛結核病。然而，BCG疫苗的功效變化很大，這取決于 臨床情況以及在其中已經測量這種功效的國家。這種功效在〇%的保護直至60%的保護之 間不等。BCG疫苗對肺結核的這種不良保護已導致一些國家的衛生機構放棄這種接種。自 2007年7月以來，法國就是如此，因為除了一些更特殊群體（如醫療保健提供者）外，BCG 接種在法國不再是強制性的。 -些實驗研究用結核分枝桿菌基因組的不同遺傳工程方法，努力提高BCG疫苗 的保護性，但到現在為止，這些構建體中未能允許開發出BCG的替代疫苗用于保護免受結 核病以及特別是肺結核。一個第一個策略是，開發產生并分泌細胞因子的BCG變體[1]。 第二個策略是，著手構建表達結核分枝桿菌30千道爾頓的抗原蛋白的重組BCG;這種構 建體在動物模型中顯示出保護作用。最后幾項研究對BCG株的基因組進行工程化，使其 分泌細菌單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素 (listeriolysin)以刺激參與結核病保護的⑶8和⑶4淋巴細胞[2]。最后一個策略轉向 通過使強毒基因（如phoP基因和mce基因）失活產生結核分枝桿菌的減毒株[3、4]。在動 物模型中，這些構建體顯示出比BCG更強的抗結核分枝桿菌感染的保護[3、4]。 如已知的，這種負責感染人類或動物的分枝桿菌屬的減毒株能夠被用于生產疫 苗，特別是通過將所述減弱的細菌插入所述疫苗。 如已知的，尤其當在真核細胞中進行體內培養時，用作疫苗的分枝桿菌的株尤其 是H37Rv株，具有不超過30天的存活時間。在實踐中，生長的降低伴隨著所述細菌在所述 細胞中壽命的減少，尤其是在體內。 在恥垢分枝桿菌（M. smegmatis)的膜提取物中，MspA孔蛋白作為一種20kDa亞基 組成的寡聚蛋白而被發現[5]。它被認為是恥垢分枝桿菌中主要和最豐富的孔蛋白[5、6]。 抑制編碼MspA的mspA基因降低恥垢分枝桿菌外膜對葡萄糖[7]、對磷酸鹽[8]、對金屬離 子和對氨基酸[9]的滲透性，表示此孔蛋白是恥垢分枝桿菌中對不同基質的主要通用擴散 通路，也允許從分枝桿菌外的介質中流入營養物[8、9]。也在其它快速生長的分枝桿菌中檢 測到編碼MspA孔蛋白的基因，比如龜分枝桿菌（Mycobacterium chelonae) [10]以及草分 枝桿菌（Mycobacterium phlei) [11]。已經顯示在結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中表達MspA 孔蛋白增加了它們對抗生素敏感性[12]。類似地，恥垢分枝桿菌的MspA孔蛋白增加牛分枝 桿此6菌株在無菌（ &161119116)介質中的生長[14]。在這些先前的研究中[12、14]，作者通 過在無菌Middlebrook 7H10瓊脂介質中的生長，確定了抗生素對于對照株結核分枝桿菌 H37Rv和表達MspA的株的最小抑制濃度。 最后，已經顯示恥垢分枝桿菌中缺失mspA基因增加恥垢分枝桿菌在小鼠巨噬細 胞中的存活（13)。 因此，遵循如下文獻： 1-不同的生物工程技術已被用來產生突變或缺失來構建結核分枝桿菌復合群的 細菌的減毒株。通過使強毒基因（如phoP基因和mce基因）失活而產生結核分枝桿菌的 減毒株的策略[3、4]，在小鼠和豚鼠動物模型中表現出比BCG對結核分枝桿菌感染更強的 保護[3、4]。然而，出于用作疫苗或生產疫苗的目的，這些生物工程技術沒有有效地用于添 加從結核分枝桿菌復合群的細菌基因組中缺失的基因。 2-沒有現有技術的研究表明mspA基因的表達能減弱結核分枝桿菌復合群的細菌 在真核細胞模型和動物模型中的生長，以及更強的原因在于它可以用作疫苗或生產疫苗。 本專利技術的目的是提供結核分枝桿菌復合群的新型株，其具有降低的生長速率，但 同時保持了其免疫原性。 疫苗領域中的技術人員不斷尋求多樣化的疫苗生產模式，以提高所述疫苗的功效 和減少副作用，并且還擴展了可受益于接種的哺乳動物譜，特別是家畜如牛。
技術實現思路
與需要失活或消除基因以失活分枝桿菌以便可用于疫苗目的的那些策略不同，根 據本專利技術，專利技術人驚奇地發現，利用分子工程方法通過基因的增加和表達，有可能減弱結核 分枝桿菌復合群的細菌。 為此，通過在所述分枝桿菌中增加和表達編碼恥垢分枝桿菌孔蛋白A的mspA基 因，本專利技術提供了一種用于降低結核分枝桿菌復合群的分枝桿菌株在真核細胞中生長的方 法，以期使其用作疫苗。 在 Georgiana E. Purdy 等人，2009 中（Molecular Microbiology. 73 卷 N。5. 1， 2009年9月，844-857頁），作者使用了結核分枝桿菌⑶C 1551株，其比結核分枝桿菌的大 多數其它株更毒[31]并因此不適合用作疫苗，并且報道由于鼠巨噬細胞感染了鼠白血病 病毒（MuLV)即RAW264. 7細胞[28]而表達mspA孔蛋白的所述轉化株在所述鼠巨噬細胞中 的活力降低。有效地，已知由于病毒干擾的現象，免疫系統細胞（如巨噬細胞）感染第一病 毒（MuLV)導致感染所述細胞[29]的第二微生物結核分枝桿菌的活力降低。考慮到制備抗 結核病的疫苗，這就是為什么作者沒有提及可能使用結核分枝桿菌的所述突變體向宿主賦 予增加的免疫力的優勢。 在Mailaender等人中[12]，與結核分枝桿菌野生型株相比，表達mspA孔蛋白的轉 化株在培養基中生長增加的結果，啟示本領域技術人員，如此轉化的株不允許在宿主真核 細胞中降低所述株的生長。在Mailaender等人，2004中[12]，作者解釋道，出于提供具有 抗結核病活性的新型分子而本文檔來自技高網...

【技術保護點】
結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)復合群的分枝桿菌株在生產用于預防宿主中結核分枝桿菌復合群的細菌感染的疫苗中的用途，在所述結核分枝桿菌復合群的分枝桿菌株中插入有能夠表達恥垢分枝桿菌(Mycobacterium?smegmatis)孔蛋白A的mspA基因，所述宿主包含真核細胞，優選巨噬細胞，所述的如此轉化的分枝桿菌株在所述真核細胞中具有降低的生長。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.05.21 FR 12546231. 結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)復合群的分枝桿菌株在生產用于預 防宿主中結核分枝桿菌復合群的細菌感染的疫苗中的用途，在所述結核分枝桿菌復合群的 分枝桿菌株中插入有能夠表達恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A的mspA 基因，所述宿主包含真核細胞，優選巨噬細胞，所述的如此轉化的分枝桿菌株在所述真核細 胞中具有降低的生長。2. 根據權利要求1所述的結核分枝桿菌的轉化株在生產用于預防哺乳動物或鳥中結 核病的疫苗中的用途，所述真核細胞是巨噬細胞。3. 根據權利要求2所述的株在生產用于預防人類中結核病的疫苗中的用途。4. 根據權利要求1至3中的一項所述的用途，特征在于插入在所述株中的mspA基因 被置于啟動子的控制下，從而允許在所述結核分枝桿菌復合群的分枝桿菌中表達所述mspA 基因。5. 根據權利要求4所述的用途，特征在于所述基因和所述啟動子插入在質粒中。6. 根據權利要求1至5中的一項...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M·德朗古，O·拉姆貝特，D·拉烏爾，
申請(專利權)人：地中海傳染基金會，
類型：發明
國別省市：法國;FR